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1、1PTDp53 融合蛋白的表达、纯化及其对 肝癌细胞的转导活性作者：丁忠阳，蔡兵，穆会君，孙力，俞悦，高云【摘要】 目的:原核表达野生型 p53 与 PTD 的融合蛋白,检测 PTD 介导 p53 进入肝癌细胞的效率。方法:利用 RT PCR 方法从 A549 细胞系中分离野生型 p53 基因,将该基因分别克隆入 pTATHA 和 pET 32a 原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS 内诱导表达并进行纯化。以纯化的 p53 蛋白经腹腔免疫 BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将 PTD p53 融合蛋白加入 HepG2 细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测 PTD p53 融合
2、蛋白导入 HepG2 细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型 p53 基因的原核表达载体,表达纯化了 p53 融合蛋白及 p53蛋白,证实 PTD p53 可以高效地转入 HepG2 细胞。结论：PTD p53 融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用 PTD p53 蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。 【关键词】 PTD p53 融合蛋白；表达；纯化；肝癌p53 基因是目前研究最广泛最深入的抑癌基因 ,在细胞受到损害导致 DNA 断裂时,p53 蛋白可使细胞分裂停滞在 G1/S 期； 如损伤不能修复,p53 基因则启动细胞的程序性死亡过程而引发细胞凋亡；一旦 p53 基因缺失或突变失活,则
3、将导致细胞恶性转化、无限制增殖从而引发癌症。因此如果将 p53 蛋白导入肿瘤细胞就能发挥有效的抗肿瘤作用。PTD(protein transduction domain)是一个富含碱性氨基酸残基的蛋白结构域,PTD 融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具1。为了探索将 p53 高效引入肿瘤细胞治疗肿瘤性疾病的新途径,我们制备了蛋白转导域2Tat 与 p53 的融合蛋白。理论上 TatPTD 可以发挥高效的蛋白转导特性将 p53 导入肝癌细胞内,并且 TatPTD 上的核定位序列还可将 p53 引入细胞核，p53 在细胞核内可以发挥其生物学活性,抑制肿瘤细胞生长2。1 材料和方法1.1 材料
4、 Trizol Reagent 购自 Invitrogen 生物技术公司；RT PCR 试剂盒、限制性内切酶及连接酶为上海塔卡拉公司产品；核酸电泳低分子质量标准蛋白质和IPTG 均为华美公司产品；质粒小量提取试剂盒、质粒纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；NiNTA agarose PD10 购自上海生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品；pTATHA 质粒由美国 Dowdy 公司提供； A549 细胞株由南京医科大学生物化学与分子生物学教研室提供；大肠杆菌 JM109 、BL21(DE3)LysS 由第三作者所在研究所保存；小鼠购买于上海实验动物中心，体
5、重 2638 g；肝癌细胞株 HepG2 细胞由南京医科大学细胞生物学教研室提供。1.2 方法1.2.1 p53 基因的克隆和原核表达载体构建 RT PCR 引物由南京奥科生物技术有限公司合成,上游引物 5GCGCGGTACCATGGAGGAGCCGCAGTCAG 3，下游引物 5 GCGCGAATTCTCAGTCTGAATCAGGCCCTT 3。在 50l 体系中进行一步法 RT PCR,纯化的 PCR 产物以 Kpn 及 EcoR 双酶切,回收酶切产物。将质粒 pTATHA 和 pET32a 分别用 Kpn及 EcoR双酶切,回收酶切产物。以 T4 DNA 连接酶将 p53 基因分别克隆入
6、原核表达载体 pTATHA 和 pET32a,转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞,以含 Amp 的固体培养基(LB)筛选阳性克隆,小量提取质粒后,用 Kpn和 EcoR双酶切鉴定。测序由上海生工生物工程有限公司3完成。1.2.2 p53 基因的克隆和表达载体的构建 将(DE3)LysS 接种于含 Amp 的 LB 培养液 37 振摇过夜,次日按 1100 转种于 2 L 新鲜的 LB 培养液继续培养 4 h,加入 IPTG 至终浓度为 1 mmolL-1,继续培养 4 h 后离心收菌。以含 8 molL-1 尿素的裂解液进行裂解,冰浴中超声 815 s,离心弃沉淀。将上清中加入 1 ml N
7、iNTA 琼脂糖,室温、150 rmin-1 吸附 1 h。5 000 rmin-1 离心 5 min 后弃上清,以 20 mmolL-1 咪唑洗涤沉淀。依次用 100、200、500 mmolL-1 咪唑溶液进行洗脱,收集洗脱液进行 SDS PAGE 分析并凝胶扫描测定蛋白纯度,BCA 法测定纯化蛋白的浓度。1.2.3 Tat p53 融合蛋白的小量表达及鉴定 以 pTATHA/p53 原核表达载体转化大肠杆菌 BL21(DE3)LysS。挑取单克隆接种于 3 ml 含 Amp 的 LB 培养液 37 振摇过夜,1100 接种于新鲜 LB 培养液振摇培养 4 h,加入 IPTG 至终浓度为0
8、.1 mmolL-1,继续培养 4 h 后,取 1 ml 菌液以 12 000 rmin-1 离心 5 min,收集菌体加入 1SDS 上样缓冲液 100l,煮沸 5 min,进行 SDS PAGE 分析。1.2.4 Tat p53 融合蛋白的大量表达与纯化 将含有 pTATHA/p53 原核表达载体的大肠杆菌 BL21 弗氏完全佐剂充分混匀,经腹腔加强免疫小鼠 1 次,2 周后尾静脉取血测定抗血清效价,处死小鼠收集血清。1.2.5 p53 蛋白的表达及纯化 以 pET32a/p53 原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,采用上血清 5 min 后加入饱和酚振荡混匀,静置 15
9、min 后保留有机相参照操作手册提取总 RNA。41.2.6 鼠抗 p53 抗体的鉴定 采用间接 ELISA 法,以纯化的 p53 蛋白(2 mgL-1)包被 ELISA 板,每孔 100l,于 4 过夜。用 PBS 洗涤 3 次,每次 1 min,加入 10 gL-1 的 BSA 室温封闭 2 h。以 PBST(0.5 mlL-1 的 Tween 20 PBS)洗 3 次,再以去离子水洗 2 次,分别加入 110 000 稀释的 p53 抗血清 1100 放置 4 h。PBST 洗 3 次,再以去离子水洗 2 次。加入底物 11 000 的 HRP 羊抗鼠 IgG,室温放置 2 h,以PBS
10、T 洗涤 5 遍,再以去离子水洗 2 遍。加入底物 TMB 液显色、浓硫酸终止反应后用酶联免疫检测仪于波长 450 nm 测定吸光度(A)值。1.2.7 PTD p53 融合蛋白跨膜转导的鉴定 将 HepG2 细胞以 2108L-1 的密度接种于内置爬片的 24 孔培养板。待细胞贴壁 24 h 后,分别加入 PTD p53 和p53 蛋白至终浓度为 800 nmolL-1。37 孵育 2 h,于冰浴上吸去培养液,4 的PBS(pH 8.0)洗涤贴壁细胞 10 min 后,每孔加入含 2%多聚甲醛、1 mlL-1 Triton100 的 PBS 溶液 1 ml,置冰上 30 min。再以 4 P
11、BS 洗涤 10 min,加入 10 gL-1 的 BSA 于 37 放置 30 min,4 的 PBS 洗涤 10 min 后,加入 p53 抗血清(1500)1 ml,37 放置 1 h 后,4 PBS 洗涤 10 min,加入 FITC 标记的兔抗鼠IgG(1100),37 孵育 1 h。以 PBS 振洗 30 min,用 500 mlL-1 的甘油封片，于荧光显微镜下观察并照相。2 结果 2.1 p53 基因的克隆及序列分析 RT PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,可见 1 条单一、清晰的条带,大小约 1 200 bp,与野生型 p53基因大小相当(图 1、2)。扫描结果显示,融合蛋
12、白的纯度为 86%。BCA 法测定融合蛋白的浓度为 0.25 gL-1。1.DNA 梯度成品； 2.p53 基因宽型的 RT PCR 产物图 1 p53 基因 RT PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）51.DNA 梯度成品； 2.pTATHA/p53 质粒； 3.pET32a/p53 质粒图 2 重组质粒酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）2.2 PTD p53 融合蛋白的表达及纯化用 pTAT HA /p53 原核表达载体转化大肠杆菌 BL21(DE3)LysS,以 IPTG 诱导融合蛋白表达。表达产物的 SDS PAGE 分析结果显示,在 120 gL-1 的 SDS PAGE 图谱上出
13、现了新的条带（如图 3）,相对分子质量约为 5 300,与 PTD p53 融合蛋白的预计分子质量相当。 2.3 p53 蛋白的表达与纯化表达载体转化大肠杆菌 BL21(DE3)LysS,表达不含 TatPTD 的 p53 蛋白,纯化产物的 SDS PAGE 分析结果见图 4。凝胶扫描结果显示,融合蛋白的纯度为 82%。BCA 法测定融合蛋白的浓度为 0.34 gL-1。1.蛋白质成品； 2.经 pTATHA/p53 而没有 IPTG 诱导转运的 BL21 大肠杆菌； 3.经 pTATHA/p53 诱导转运的 BL21 大肠杆菌； 4.经 p53 IPTG 诱导转运的 BL21大肠杆菌；5.经
14、 20 mmolL-1 咪唑洗涤的大肠杆菌； 6.经 100mmolL-1 咪唑萃取的大肠杆菌； 7.经 200 mmolL-1 咪唑萃取的大肠杆菌； 8.经 500mmolL-1 萃取的融合蛋白图 3 纯化的 PTD p53 表达产物的 SDS PAGE 鉴定（略）13. 依次为经 500、200、100 mmolL-1 咪唑萃取的大肠杆菌； 4 经 20 mmolL-1L 咪唑洗涤的大肠杆菌； 5 经 pET32a/p53 而没有 IPTG 诱导转运的BL21 大肠杆菌； 6 融合蛋白成品图 4 p53 纯化产物的 SDS PAGE 分析 （略）6图 5 PTD p53 融合蛋白导入 He
15、pG2 细胞的免疫荧光检测结果（略）2.4 PTD p53 跨膜转导的鉴定为了确定 PTD p53 融合蛋白能否跨膜导入肿瘤细胞,我们将 PTD p53 融合蛋白及不含 Tat 的 p53 蛋白分别加入 HepG2 细胞培养上清,进行间接免疫荧光检测。在荧光显微镜下观察,发现加入 PTD p53 融合蛋白的实验组细胞均出现较强的绿色荧光,而对照组细胞无荧光出现,说明 TatPTD 可将 p53 蛋白高效地导入 HepG2 细胞(图 5)。3 讨论肿瘤的发生是多种基因改变综合作用的结果。研究证实，肿瘤在形成的过程中，涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，其中以抑癌基因的失活更为重要3。p53 基
16、因是目前研究最广泛最深入的抑癌基因，迄今已发现的肿瘤中,p53 蛋白的393 个氨基酸就有 280 个以上发生了突变4。鉴于人类恶性肿瘤 p53 基因突变率较高,抑癌基因 p53 突变与肿瘤的发生有密切关系,以正常 p53 蛋白治疗肿瘤就自然成了研究的热点5。2002 年 Kunnihisa 等6将野生型 p53 基因导入人类前列腺癌细胞 PC3 中,发现肿瘤细胞形态改变,细胞生长速度降低,裸鼠致瘤性消失,进一步研究发现肿瘤抑制是其凋亡增加所致。Ramesh 等7用脂质体作载体将 p53 导入肺的原位癌和转移癌中,以及 Hagivara 等8将载有野生型 p53 的腺病毒载体直接进行实体瘤体内注射,均可使动物的生存期明显延长。p53 的失活或突变是肝癌发生的重要分子病理基础，肝癌组织中不仅有大量的 p53 表达，而且在体外培养的肝癌细胞中导入 p53 也可以有效地抑制肿瘤细胞的生长9。肝癌是严重危害人类生命健康
