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1、1QLFATINSTL(93102aa)是隐球菌抗原 MP98 CTL 优势表位作者：谷明莉，邓安梅，周晔，陈燕，陈波，仲人前，温海，陈孙孝 【摘要】 目的 鉴定隐球菌抗原 MP98 中的 HLA A*0201 限制性 CD8+CTL 表位。方法 应用数据库 SYFPEITHI 预测隐球菌 MP98 中可能存在的 HLA A*0201 限制性 CD8+CTL 表位，经流式细胞术分析各抗原肽与 HLA A*0201 的亲合力，经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应，经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性 T 细胞的细胞毒杀伤活性，逐步鉴定MP98 的 HLA
2、A*0201 限制性 CD8+CTL 表位。结果 位于 MP98 氨基酸序列肽3(93 102aa)与 HLA A*0201 分子具有较高的亲合力，并都能刺激 HLA A*0201阳性个体 PBMC 增殖，并诱导产生具有特异性杀伤活性的 CTL。结论 肽 3 QLFATINSTL(93 102aa)是抗原 MP98 上 HLA A*0201 限制性 CD8+CTL 的优势表位，可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。 【关键词】 隐球菌；细胞毒性 T 细胞；抗原表位Abstract： Objective To identify HLA A*0201 restricted CD8+CTL epitope
3、s in Cryptococcus neoformans MP98.Methods Firstly, database SYFPEITHI was applied to predict HLA A*0201 restricted CD8+CTL epitopes in Cryptococcus neoformans MP98. Secondly, affinity and stability of the predicted peptides with T2 cell were assayed by FACS. Thirdly, cells proliferation and cytotoxi
4、city induced by peptides were investigated by DELFIA cell proliferation assay and DELFIA EUTDA cytotoxicity test, respectively. Results Peptide 3 (QLFATINSTL, 93 102aa) had high affinity to HLA A*0201 molecules, and stimulated PBMCs in healthy donors to proliferate and induce antigen specific CTLs.
5、Only peptide 6 could give a positive proliferation response and specific cytotoxicity. Conclusion Peptide 3 (QLFATINSTL, 93 102aa) is the HLA A*0201 restricted CD8+CTL epitope of Cryptococcus 2neoformans MP98, which shows that it can be the candidate for peptide based vaccine.Key words： Cryptococcus
6、 neoformans; epitope; cytotoxic T lymphocyte近年来，隐球菌性脑膜炎的发病率呈明显上升趋势。尤易伴发于 HIV/AIDS 等免疫缺陷患者。该病治疗困难，治愈率低，已成为这类人群致死的主要原因之一12。在隐球菌感染的人群中只有免疫力功能较为低下的个体才易于发病，而在机体隐球菌感染中越来越多的研究表明，特异性细胞免疫发挥着重要作用。因此，开发研制新的预防和治疗隐球菌的疫苗，具有重要意义和广泛的应用前景3。HLA A*0201 在多数人群中普遍存在，其频率40%，进行 HLA A*0201 限制性 CTL 表位的研究将更具有现实意义。 本课题利用生物信息学数
7、据库对隐球菌抗原 MP984中可能存在的HLA A*0201 限制性 CD8+CTL 表位进行初步预测，然后进行抗原肽 HLA 分子亲合力和稳定性分析，采用时间分辨荧光法(DELIFA)对抗原肽诱导的细胞增殖反应、CTL 细胞毒活性进行研究，逐步鉴定出 QLFATINSTL(93 102aa)是隐球菌抗原 MP98 CTL 优势表位。1 材料和方法1.1 研究对象 10 例 HLA A*0201 阳性健康志愿者，10 例 HLA A*0201 阴性健康志愿者，留取外周血 10 ml，肝素抗凝。12 试剂和材料 RNA 抽提试剂盒购自 Qiagen 公司；LPS、人重组IL 2、DMSO、BFA
8、、2 mg 均购自 Sigma 公司；淋巴细胞分离液LymphoprepTM 购自挪威 AXIS SHELD 公司；人重组 GM CSF、人重组 IL 4购自 RD 公司；FITC 标记的抗 CD3、抗 CD8、抗 HLAA2 流式单克隆3抗体均为 Caltag 公司产品；RPMI1640 培养基和胎牛血清购自 Gibco 公司；时间分辨荧光 DELFLA 细胞增殖(AD0200)与细胞毒性(AD0116)检测试剂盒均购自Perkin Elmer 公司；多肽由上海生工生物工程技术有限公司合成；T 2 细胞株由上海长征医院临床实验诊断科保存。13 主要仪器 流式细胞仪(Coulter EPICS
9、 XL)；时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235，Perkin Elmer)。14 HLA 分型 先以鼠抗人 HLA A2 单克隆抗体(BB72)进行 HLA A2 流式初步筛选，然后再以 HLA A2 高分辨 SSP PCR 试剂盒进一步确认其HLA A*0201 亚型。1.5 表位预测和多肽合成 应用数据库 SYFPEITHI 对隐球菌 MP 98 进行HLA A*0201 限制性 CTL 表位预测，根据多肽上的氨基酸是否为锚定残基、辅助残基或优势残基进行记分，分值高于 18 分者有可能是 T 细胞表位5。由上海生工生物工程技术有限公司以 F moc 化学法合成上述预测得到的多肽，合成
10、的抗原肽均经高效液相色谱纯化(纯度95%)，并经质谱鉴定。16 抗原肽亲合力分析 采用 T 2 细胞株进行抗原肽亲和力分析，其原理主要是利用 T 2 细胞系的特点。T 2 细胞表面空载的 HLA A2 分子表达极不稳定，递呈后很快降解，抗原肽与之结合后稳定了 HLA A2 的表达，因此抗原肽与HLA A2 的结合力越强，T 2 细胞表面 HLA A2 分子的表达量就越高。而且由于 T 2 细胞的内源性抗原递呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺乏，所以 T 2 细胞表面 HLA A2 分子的表达量的增加更加直观的反映了外来抗原肽与HLA A2 的结合力。具体方法为：T 2 细胞以 pH3.
11、2 的柠檬酸钠磷酸盐缓冲液4预处理 1 min，使细胞表面的 MHC 类复合物变性，立即用过量的 RPMI 1640 培养液洗 1 遍，调节细胞浓度至 3105，以 1 ml/孔种于 24 孔细胞培养板。以抗原肽(20 mg/L)刺激，补充 Brefeidin 和 2 MG，37 5%CO2 饱和湿度孵育 4 h，并以未加抗原肽为空白对照孔。收集细胞，以 FACS(含 0.2%FCS 和 0.1%叠氮钠的PBS)洗 l 遍，用 FITC 标记的小鼠抗人 HLA A*0201 单克隆抗体染色，常温暗处反应 30 min，流式细胞仪(Coulter EPICS XL)检测平均荧光强度。每个实验重复
12、 3次，平均荧光强度高于空白对照孔平均荧光强度+3SD 的抗原肽具有HLA A*020l 高亲和力。17 抗原肽稳定性分析 T 2 细胞同前预处理，将抗原肽浓度提高至 80 mg/L，37 5%CO2 饱和湿度孵育 18 h，补充 BFA 至终浓度为 10 mg/L，继续孵育 3 h。收集细胞，同前测平均荧光强度。平均荧光强度高于空白对照孔平均荧光强度+3SD 的抗原肽具有与 HLA A*0201 稳定性结合特性，并将其进行细胞增殖反应及细胞毒性实验。第 1 期 QLFATINSTL(93 102aa)是隐球菌抗原 MP98 CTL优势表位 谷明莉，等18 抗原肽诱导 CTL 制备 将密度梯度
13、离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，得到的 PBMCs 种于含 10%FCS 的RPMI 1640 培养基的 6 孔细胞培养板中，37 5%CO2 孵育 15 h。收集悬浮细胞(主要为淋巴细胞)。贴壁细胞为抗原提呈细胞树突状细胞(DC)，补充含GM CSF、IL 4，及含 10%FCS 的 RPMI 1640 培养液，37 5%CO2 培养 7d。5 d 后，加入 LPS 培养 2 d 后， 照射使其失去增殖活性。将经过照射的 DC 与抗原肽(10 mol/L)在培养液中，37 5%CO2 共孵过夜。将 1105 负载
14、有抗原肽的 DC与 1106 自体 PBMCs 种于 24 孔细胞培养板，37 5%CO2 混合培养 3 d 后，加5入 rlL 2(20 U/ml，Sigma)继续培养 10 d，进行细胞增殖实验和细胞活性检测。19 细胞增殖实验 采用时间分辨荧光 DELFIA 细胞增殖检测试剂盒(AD0200，Perkin Elmer)，将经辐射的 5103 负载抗原肽的 DC100 l 与 5104 抗原肽诱导的自体 CTL 种于 96 孔细胞培养板，并以未负载抗原肽的 DC 作为阴性对照。加入 20 l BrdU 标记液孵育 10 h，离心取沉淀，加入 Eu 标记的抗 BrdU 单抗，室温孵育 2 h
15、，洗涤，固定。时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235)检测荧光强度，每个样本设 3 个复孔，取平均值为检测结果。增殖系数(SI)=含抗原肽的平均荧光强度/阴性对照的平均荧光强度，SI2 的抗原肽我们将视为能诱导淋巴细胞增殖。110 细胞毒性分析 采用时间分辨荧光 DELFIA EUTDA 细胞毒性试验（AD0116，PerkinElmer），检测杀伤活性。参照说明书进行操作，效应细胞与靶细胞的比例为 40：1，培养 4h。时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235)检测荧光强度，每个样本设 3 个复孔，取平均值为检测结果。细胞杀伤活性=(待测孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)/(最大释放孔荧
16、光强度-自然释放孔荧光强度)100%。 2 结果21 表位预测及多肽合成结果 经生物信息学预测，选择以下肽序列进行合成(表 1)。合成的多肽经质谱鉴定，纯度经高压液相色谱(HPLC)分析均95%。22 抗原肽亲合力及稳定性分析结果 上述合成的抗原肽与 HLA A*0201 结合活性见表 1。 经抗原肽 3 处理后的细胞平均荧光强度出现升高。 抗原肽与HLA A*0201 分子结合的稳定性分析结果显示， 抗原肽与 T 2 细胞上的HLA A*0201 分子结合后， 抗原肽 3 能使 T 2 细胞 HLA A*0201 分子表达稳定上调， 以 T 2 细胞平均荧光强度经抗原6表 1 抗原肽刺激后的 T 2 细胞 HLA A*0201 平均荧光强度（略）肽处理后的增长倍数(增长倍数=抗原肽处理后的平均荧光强度/无抗原肽的平均荧光强度)为 Y 轴作图(如图 1 所示)。根据结合力和稳定性结果，选择抗原肽 3继续下游实验。图 1 HLA A*0201 抗原肽的亲和力和稳定
