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1、1HBV 感染胎盘滋养细胞的体外研究作者：陈天艳，陈云茹，刘敏，牛迎花，蔺淑梅，叶峰，张曦，刘锦锋，赵英仁，张树林 【摘要】 目的： 对早孕绒毛的滋养细胞进行原代培养，利用 HBV 感染血清对滋养细胞进行体外感染，探讨细胞在体外培养条件下对 HBV 的感染率及 HBV 在细胞中的复制状态. 方法： 利用胰蛋白酶和胶原酶联合消化培养法原代培养早孕胎盘中的滋养细胞，并进行免疫组化鉴定，获得纯度较高的滋养细胞后进行体外的 HBV 感染，通过细胞免疫化学染色、ELISA 及 PCR 法分别检测细胞上清中的HBsAg，细胞中的 HBV DNA 及 cccDNA. 结果： 原代培养的滋养细胞，细胞生长良好
2、，特异性角蛋白 7 阳性，纯度高. 原代滋养细胞在与 HBV 阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变，感染后 24 h 和 48 h 在滋养层细胞细胞浆中可见HBsAg 的阳性表达，被感染细胞呈散在分布. 感染后 48 h 起可检测到弱阳性的HBsAg 及 HBVDNA，感染后细胞内未检测出 cccDNA. 结论： 利用联合酶消化法建立了胎盘中滋养细胞的体外培养系统. HBV 能够在体外感染原代培养的滋养细胞，对被感染细胞的生长无明显影响. HBV 可能不在滋养细胞中复制. 【关键词】 乙型肝炎病毒；滋养层细胞；原代细胞培养【Abstract】AIM: To set up the prima
3、ry culture model of trophoblastic cells from human placenta and to investigate the infection ratio and replication of trophoblastic cells co cultured with HBV infection serum. METHODS: Using trypsin and collagenase associated digestion, trophoblastic cells were obtained from human placenta. Immunohi
4、stochemistry staining of the cells were done for identification of primary culture cells by specific anti cytokeratin 7. Trophoblast cells were co cultured with HBV infection serum for 24 h. The infection efficiency was examined by ELISA of culture supernatants, immunohistochemistry of cell slides a
5、nd 2PCR amplification for HBV DNA and cccDNA of infected cells. RESULTS: The primary culture model of trophoblastic cells from human placenta was established successfully. Observation of the morphology of trophoblastic cells showed that no significant cytopathic effect was found when co cultured wit
6、h HBV. No significant destruction of cellular structure or cell cell junction was found. Culture medium was collected at 24, 48 hours after infection, respectively. Secretion of HBsAg was observed at 48 hours post infection. Both membrane and cytoplasmic localization of HBsAg were observed. The infe
7、cted cells were in a diffused distribution. The frequency of HBsAg positive cells at different time points did not show any significant changes. HBV infected cells had very light specific band of HBV DNA and no cccDNA was observed. CONCLUSION: We establish a primary culture model of trophoblast cell
8、s. Our study indicates that trophoblastic cells cultured in vitro can be infected by HBV. But the efficacy of infection is low. The replication of HBV in trophoblastic cells is not observed.【Keywords】hepatitis B virus; trophoblastic cells; primary culture0 引言HBV 母婴垂直传播可发生于宫内、产程和产后1. 随着我国将乙肝疫苗纳入计划免疫，
9、宫内感染逐渐成为乙肝免疫失败的重要原因，阻断宫内感染将是控制我国乙肝流行和预防 HBV 相关疾病的关键. 胎盘被认为是宫内感染最主要的途径2. 胎盘是母体与胎儿之间的物质交换的桥梁，在 HBV 母婴传播中，它不仅是一个物理屏障，也构成了 HBV 宫内感染胎儿的通道. 由于胎盘屏障的第一层细胞是滋养层细胞，该层细胞直接与母亲血液接触，因此，HBV 宫内感染的实现必须建立在 HBV 成功跨越胎盘屏障滋养层细胞的基础上. 既往研究3显示HBV 可感染胎盘组织中的各类细胞，但大多是临床病理结果，体外研究很少. 建立在滋养层细胞来源的肿瘤细胞系中的研究固然方便，但在其实验结果的解释上及其适用性方面逊于原
10、代培养细胞. 本研究利用消化法培养原代胎盘滋养层细胞，建立胎盘细胞的体外培养系统. 利用 HBV 感染血清进行体外感染，探讨体外培养条件下对 HBV 的感染率及病毒在细胞中的复制状况，为进一步的研究奠定基3础，为控制 HBV 宫内胎盘感染提供新的线索.1 材料和方法1.1 材料 DMEM（高糖型）培养基（含有 HEPES 和 L 谷氨酰胺）和胎牛血清(美国 Hyclone 公司)；胰蛋白酶和胶原酶 I （美国 Sigma 公司）；抗角蛋白 7 IgG，波形蛋白 IgG，鼠抗人 HBsAg mAb，HBVM ELISA 试剂盒，羊抗小鼠链霉亲和素 过氧化物酶免疫组化试剂盒(北京中杉科技有限公司)
11、；青、链霉素（宝生物大连有限公司）. HBV DNA 及 cccDNA PCR 引物由上海生物工程公司合成，610 wk 人工流产胎盘绒毛组织由我院妇产科门诊手术室提供.1.2 方法1.2.1 滋养细胞的分离培养将新鲜绒毛组织置于无菌培养皿中，用 0.01 mol/L PBS 液（含青霉素 500 U/mL，链霉素 500 U/mL）冲洗数遍，去除血污，剪去膜状物、肉眼可见的血管，将绒毛剪碎至约 1 mm3 大小，似糊状，放入 15 mL 离心管中 加入 2 倍体积的胰蛋白酶（终浓度 1.25 g/L）与胶原酶 I 混合液胶原酶 I(终浓度 1 g/L），用吸管吹打均匀后于 4冰箱过夜 第 2
12、 日取出，放入 37水浴箱中，消化15 min 后，小心移去上清液，加入相同体积胰蛋白酶(终浓度 2.5 g/L)与胶原酶 I混合液（终浓度 0.4 g/L），混匀，37水浴箱中消化 15 min. 消化后立即以等体积100 g/L FCS DMEM 中和，以吸管轻轻吹打绒毛组织，使组织分解，经 200 目不锈钢滤网过滤，去除残余未消化组织，收集滤液. 滤液于 15 mL 无菌离心管中，1000 r/min，离心 5 min, 弃上清，沉淀用含有双抗的无血清 DMEM 清洗两遍. 用无血清的 DMEM 重悬细胞，调整细胞数为 8106/mL，将细胞接种于 1 号培养瓶内，37 50mL/L C
13、O2 培养箱培养 10 min，镜下观察，见部分细胞贴壁，稍加振荡也不浮起时，收集附壁未牢的细胞，接种于 2 号培养瓶内，37再静止 10 min，轻轻晃4动，再将未贴壁细胞悬液移入离心管中，1000 r/min 离心 5 min，用含 200 mL/L 胎牛血清培养液重悬细胞，37，50 mL/L CO2 孵箱培养. 接种 24 h 后更换培养液，每隔 34 d 换培养液 1 次，每日观察细胞，在倒置显微镜下直接观察细胞形态和生长状态.1.2.2 人绒毛膜滋养细胞的 HE 染色待细胞在盖玻片上附壁伸展生长后，PBS 冲洗两遍，用 950 mL/L 乙醇固定细胞 3 h，苏木素染色 3 min
14、，自来水冲洗，5 mL/L盐酸酒精分色，自来水冲洗，伊红染色 1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，光镜观察.1.2.3 人绒毛膜滋养细胞的免疫组化染色对细胞爬片进行抗角蛋白 7 IgG 及波形蛋白 IgG 的免疫细胞化学染色，按操作步骤进行. 胞浆内有棕黄色颗粒者判定为阳性1.2.4 原代培养的滋养层细胞的 HBV 感染将生长对数期的原代滋养层细胞消化传代，以 2105 /mL 接种于 3 个 50 mL 培养瓶，当细胞培养生长至培养瓶底的 70%时，弃去原培养液，用无血清的 DMEM 洗涤细胞两次，加 4 mL 经 DMEM 稀释的HBV 阳性血清(3107 拷贝/mL)感染细胞
15、，分别加 4 mL 经 DMEM 稀释的 HBV阴性血清及 4 mL FBS DMEM 作为阴性对照及空白对照. 37 50 mL/L CO2 中孵育 48 h 后，经胰酶消化后用 0.01 mol/L PBS 清洗细胞 5 次，并收集第 5 次洗液，重新接种细胞以 10 g/L FBS DMEM 4 mL 继续培养，于 12, 24 和 48 h 分别收集细胞培养上清，分别应用 ELISA 法及 PCR 法检测 HBsAg. 48 h 后收集感染细胞检测 HBV DNA 及 cccDNA. 以 1105 个/mL 接种 6 孔板(预先放置经处理的盖玻片)，6 孔板亦如上设组，每两孔为一组，分
16、别加入含不同血清的培养液 2 mL，48 h 后5收集 6 孔板中细胞爬片进行 HBsAg 的免疫组化. 1.2.5 感染后检测细胞上清HBsAg 检测按 ELISA 操作说明进行；细胞免疫组化染色按常规进行；细胞中HBVDNA 采用套式 PCR 方法，引物设计在 HBV 的 S 基因保守序列，扩增产物长度分别为 416 bp, 206 bp. cccDNA 检测参考文献4的方法. 扩增产物长度分别为1149 bp，426 bp. 每次试验均设阳性，阴性及空白对照.2 结果2.1 细胞形态学滋养细胞多呈上皮样细胞生长，形态多样，多数为方形或类圆形，细胞伸出较多伪足，胞浆丰富，胞核大，呈圆形，有多核细胞（图 1）. 滋养细胞的免疫组化鉴定可见滋养层细胞角蛋白 7 染色阳性波形蛋白染色阴性（图 2）.2.2HBV 体外感染后的检测 ELISA 检测培养上清 HBsAg 结果显示感染后 48 h时细胞可检测到 HBsAg，其他时点、空白对照组及阴性对照组细胞上清中均未检测到 HBsAg. HBV 感染对滋养层
