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1、1DNA 修复酶在胃癌组织中的表达变化及 临床意义作者：吴迎爽 周宁 程毅 魏贵亮 谢震 祁贺 薄爱华 张晓丽 邢立强 【摘要】 目的：检测胃癌组织中 DNA 损伤修复酶(O6甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶 O6methylguanine DNA methyltransferase, MGMT)的表达变化，探讨其表达和胃癌临床病理特征之间的关系,进一步用于指导临床化疗方案的制定。方法：采用免疫组化方法（SABC 法）检测 55 例胃癌标本中 MGMT 的表达情况。结果：MGMT 在胃癌组织中的阳性表达率为 43.64%（24/55），其阳性表达与年龄、病理类型有关，而与性别、分化程度、侵犯深度、
2、淋巴结转移的相关性不明显。结论：MGMT 对胃癌化学治疗方案的制定有指导作用。 【关键词】 胃癌；DNA 损伤修复酶；免疫组化【ABSTRACT】 Objective: To investigate the expression change of DNA repairing enzyme MGMT in gastric carcinoma,and the relationship between the expression and pathologic charateristic,so as to guide makingup of treating plan. Methods: Dete
3、ct the expression of 55 cases with gastric carcinoma by SABC immunohistochemistry. Results:The positive expression rate of MGMT in the gastric carcinoma was 43.64%(24/55).There was a signficant statistic difference between age and pathologic type in the expression of MGMT, but no obvious correlation
4、 among sex, defferentiation degree,invasion depth and lymphnode metastasis.Conclusion:The expression of MGMT can guide to make up a plan for treating gastric carcinoma.【KEY WORD】 Gastri carcinoma; DNA repairing enzyme(MGMT); Immunohistochemistry烷化剂与 DNA 相互作用可以在 DNA 分子中形成各种烷化碱基，其中 O6甲基鸟嘌呤与基因突变和癌症发生关系
5、最为密切。生物体内含有一种高度专一性2DNA 修复酶即 O6甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶（O6methylguanineDNA methyltransferase MGMT），该酶能够有效地修复 DNA 分子中 O6 位鸟嘌呤的烷化碱基,在防止烷化剂诱导的致癌、致突变和抗癌化疗过程中均起重要作用1，从而有效维持着基因组的稳定。本文主要讨论 DNA 损伤修复酶 MGMT 在胃癌中的表达变化及其与胃癌临床病理特征之间的关系,进一步用于指导胃癌化学治疗方案的制定。1 资料和方法1.1 标本来源 收集河北北方学院附属第一医院肿瘤外科 2002.32005.4 月间胃癌根治术切除的 55 例标本。其中女
6、性患者 17 例,男性患者 38 例;年龄在 2979岁之间,平均年龄为 53.87 岁;高分化腺癌 28 例,中分化腺癌 6 例,低分化腺癌 12 例；粘液腺癌 9 例。所有患者术前均未经化疗和放疗。1.2 试剂 兔抗人 MGMT 多克隆抗体购自武汉博士德生物有限公司,SABC 免疫组化试剂盒及 DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技有限公司。1.3 方法 （1）术后立即取材,以 4%多聚甲醛 0.1MPSB(pH=7.2 内含0.1PS)固定约 3h,常规脱水，浸蜡，包埋,连续切片,厚度约 5m；（2）将切片贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,常规脱蜡至水；（3）抗原热修复：将切片浸入0.0
7、1M 枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热至沸腾，间隔 510min,反复 12 次；（4）滴加 5%BSA 封闭液,室温 20min;(5)滴加一抗(兔抗人 IgG),4过夜;(6)0.01mol/L PBS 冲洗 2min3 次;(7)滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG,2037,20min;(8)0.01mol/L PBS 冲洗 2min3 次;(9)滴加试剂 SABC,2037,20min;(10)0.01mol/L PBS 冲洗 5min4 次;(11)DAB 显色;(12)脱水,透明,封片。3阴性对照，以 PBS 代替一抗，其余步骤相同；阳性对照片为已知人胃癌阳性组织切片。1.4 结果判定 光镜
8、下观察 MGMT 阳性物质分布在胞浆中,呈棕黄色。每张切片中阳性细胞数5%为阳性病例,阳性细胞数5%为阴性病例。1.5 统计学处理 组间比较采用 2 检验。2 结果55 例胃癌中，MGMT 阳性表达为 24 例，阳性率为 43.64%，其阳性表达与年龄、病理类型有关,与性别、分化程度、侵犯深度、淋巴结的转移的相关性不明显(详见表 1)。表 1 MGMT 表达与性别、年龄、病理类型、侵犯深度、淋巴结的转移临床病理特征的关系(55 例)注: MGMT 在年龄中阳性表达比较 * P0.05;MGMT 在管状型腺癌和黏液型腺癌中阳性表达比较 P0.05。 3 讨论人类 DNA 在自身及环境中受各种有害
9、因素的作用不断的发生损伤，同时又通过各种各样修复系统修复 DNA 损伤维持机体的稳定。烷化剂是一类重要的诱变剂及致癌物质，其分子中的一个或多个烷基(主要是甲基或乙基)，可转移到 DNA 分子碱基上，形成烷基加合物。其中 O6甲基鸟嘌呤是亚硝氨等烷化剂和 DNA 碱基形成的并与致癌作用有关的一种主要加合物。人 MGMT 基因定位染色体10q26 上,全长约 170kb,被 I-kilohase mRNA 编码，其抵抗细胞毒的作用主要取决于肽链 145 位上的半胱氨酸位点，含 5 个外显电子，其中第一个外显电子不翻译，而是参与基因的表达调控2。其作用原理是：MGMT 可将鸟嘌呤 O6 位的甲基转移
10、到自身的半胱氨残基上，在体蛋白分子中形成 O6甲基转移酶，DNA 分子甲4基鸟嘌呤则脱去甲基，整个甲基转移过程无其他蛋白参与，也就是说同一蛋白既作为甲基转移酶又作为甲基受体蛋白3。这种“自杀”式的反应机制使得机体烷基加合物的修复能力取决于 MGMT 在细胞内的含量及其合成速度。因此 MGMT 在保护细胞免受烷基类物质的毒性、抑制基因突变性和致癌活性方面均具有决定性作用。总之,MGMT 是一种重要的 DNA 修复蛋白,其基因组结构及表达异常与肿瘤的发生有关。事实上有人已将这种编码 DNA 修复蛋白的基因称为潜在癌基因或抗癌基因。最近研究表明，MGMT 蛋白表达的缺失或突变与许多恶性肿瘤有关，包括
11、胰腺癌、结肠癌、神经角质瘤、睾丸的非精原细胞癌等4。本实验表明，胃癌中MGMT 的阳性表达低于阴性表达，提示 MGMT 阳性表达缺失与胃癌的发生有关，由此可推测组织中 MGMT 异常，不能发挥正常的作用或作用不足时该加合物与胸腺嘧啶错配，发生 GCAT 突变，导致癌基因激活，进一步促使组织细胞向恶性肿瘤转变。从这个角度考虑,检测 MGMT 阳性表达高低对肿瘤的预见有重要的临床指导意义。同时本文研究表明不同年龄段阳性表达高低不同,从而在临床上对不同年龄段病人可以采取不同的治疗方案。例如本组资料中年龄在 4560岁之间的患者阳性表达较高,需要采取烷化剂抗癌物质进行化学治疗方法。耐药是恶性肿瘤化疗成
12、功的主要障碍,如何预见和克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是肿瘤化疗急需解决的问题。MGMT 在防止烷化剂诱导的致癌、致突变和抗癌过程中以及肿瘤对烷化类抗癌药物的耐药方面发挥着双重作用5。有研究表明 MGMT 酶活性低的细胞（Mer-）对烷化类抗癌药物敏感，而酶活性高的细胞(Mer+)则对烷化类抗癌药物有抗性6，因此 MGMT 酶活性可以作为评价胃癌预后的一个生物学指标。本组资料研究表明 MGMT 在胃癌组织中管状腺癌表达活5性低于黏液型腺癌,即提示管状腺癌对烷化类抗癌药物敏感。有研究表明野生型P53 能抑制肿瘤细胞 MGMT 表达及活性,提高肿瘤细胞对烷化类抗癌药物的敏感性7。抑制 MGMT 酶
13、活性可以在基因治疗中起到增强化疗药疗效果的作用。因此检测胃癌组织中 MGMT 表达状况将对临床化疗药物的选择有重要意义。【参考文献】1 董红梅,沈忠英.DNA 修复酶 MGMT 与肿瘤关系的研究进展J.癌变畸变突变，1999，21（3）：1291312 梁刚.MGMT 在原发性肝癌中的表达及其临床意义J.中国现代医学杂志，2005，15（4）：100910113 王亮.O6甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶与肿瘤J.国外医学肿瘤分册，1999，26（3）：1291314 张天华,邹小明,刘建丰,等.MGMT 蛋白在胃癌中的表达及临床意义J.中国普通外科杂志，2005，14（3）：2252265 杨军,陈建民,章扬培.O6甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶基因表达提高肿瘤细胞的烷化抗性J.科学通报，1996，22（1）：2536 金顺钱,张伟.参与肿瘤转移的细胞表面粘连受体J.国外医学肿瘤学分册1994，21（3）：1301327 黄长军,博继梁.从 DNA 修复机理看细胞癌变的发生机制J.生物化学与生物物理进展，1996，23（5）：413414
