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1、1痛泻要方抑制大鼠离体结肠平滑肌收缩 的钙动员机制作者：袁建业, 谢建群, 吴大正, 郑昱, 潘相学, 费晓燕, 徐海珍【摘要】 目的：从影响钙动员角度，探讨痛泻要方抑制大鼠结肠平滑肌收缩的作用机制。方法：应用离体平滑肌张力测定方法，观察痛泻要方对乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）、氯化钾（KCl）和细胞内钙库耗竭后细胞外 Ca2+内流引起的大鼠结肠平滑肌收缩的影响。结果：痛泻要方能够抑制 KCl 和细胞内钙库耗竭后细胞外 Ca2+内流引起的大鼠结肠平滑肌收缩，并呈浓度依赖性。3 000 g/mL 痛泻要方还能抑制 ACh 引起的第二收缩时相张力，与不加药的对照组（Krebs 液
2、）比较，差异有统计学意义（P0.01）；痛泻要方对 ACh 引起的第一收缩时相张力无明显影响。结论：痛泻要方主要通过抑制胞外 Ca2+内流来抑制大鼠结肠平滑肌的收缩，可能涉及到阻断电压门控钙通道、钙库调控性钙通道和受体操纵性钙通道，但不影响 ACh 引起的胞内 Ca2+释放。 【关键词】 痛泻要方; 结肠; 平滑肌; 钙动员; 大鼠Objective: To study the relationship between the inhibitory effects of Tongxie Yaofang, a compound traditional Chinese herbal medicin
3、e, on the contraction of the colonic smooth muscle isolated from rats and calcium mobilization.Methods: By measuring the tension of the isolated colonic smooth muscle strips, the inhibitory effects of Tongxie Yaofang on the contraction induced by acetylcholine (ACh), KCl and exhausting Ca2+ of inter
4、nal calcium store were assessed respectively.Results: Tongxie Yaofang could concentration dependently inhibit the contraction of isolated rat colonic smooth muscle strips induced by KCl and exhausting the Ca2+ of internal calcium store. Tongxie Yaofang could also inhibit the tension of the second co
5、ntractile phase induced by ACh (P0.01, vs control), but had no influence on the 2first contractile phase.Conclusion: Tongxie Yaofang can inhibit the contraction of isolated rat colonic smooth muscle strips mainly by preventing the influx of extracellular Ca2+, which may be associated with blocking v
6、oltage dependent channel, store operated channel and receptor operated channel, but not by preventing the release of internal Ca2+ from calcium store.Keywords: Tongxie Yaofang; colon; smooth muscle; calcium mobilization; rats痛泻要方是中医治疗“痛泻”证的名方，最早见于丹溪心法卷二1。许多临床研究报道以痛泻要方为基础方治疗腹泻型肠易激综合征取得良好疗效2，3。药理实验表明，
7、痛泻要方对大鼠、兔等实验动物的肠平滑肌收缩具有抑制作用4，5，但具体作用机制尚不完全清楚。本实验从钙动员角度探讨痛泻要方抑制大鼠离体结肠平滑肌收缩的作用机制。1 材料与方法1.1 实验动物 18 只健康成年 SD 大鼠，雄性，清洁级，体质量 200300 g，购自中国科学院上海实验动物中心，动物使用许可证号为 SYXK（沪）2007 0005，饲养在上海中医药大学实验动物中心，实验前禁食 24 h，不禁水。1.2 药物与试剂 痛泻要方（由白术、白芍、陈皮、防风组成），生药饮片一次性购自上海华宇药业有限公司；乙酰胆碱（acetylcholine, ACh），购自 Sigma 公司（批号为 97H
8、2649）；EGTA（ethylene glycol bis( aminoethylether)N,N,N,N tetraacetic acid），购自 Sigma 公司（批号为 E 4378）；毒胡萝卜内酯（thapsigargin），购自 Sigma 公司（批号为 T 9033）；Krebs 液（NaCl 115 mmol/L、NaHCO3 25 mmol/L、KCl 2.4 mmol/L、KH2PO4 0.6 mmol/L、CaCl2 1.2 mmol/L、MgCl2 1.2 mmol/L、glucose 10 mmol/L），除 NaHCO3 为 Sigma 公司产品外，其余所用试剂均
9、为国产分析纯。无钙 Krebs 液，即 Krebs 液去掉 CaCl2。31.3 仪器设备 PowerLab/4SP 数据处理与分析系统、MLT02021D 型张力传感器，购自澳大利亚 ADI 公司；501C 型超级恒温水浴箱，购自上海实验仪器厂；电热恒温水温箱，购自上海医疗器械五厂；自制的离体张力测定灌流系统。1.4 痛泻要方的制备 按比例（白术白芍陈皮防风=321.51）称取一定量的饮片，加 8 倍体积的水，煎煮 3 次，每次 1 h，合并 3 次水煎液过 80 目筛，然后将滤液浓缩至生药含量为 12 g/mL。加入乙醇使乙醇浓度达 90，静置过夜，取上清液，用旋转蒸发仪回收乙醇后将药液置
10、入真空干燥箱内干燥，并研末装入密封袋内备用。1 g 生药得到 0.105 g 提取物。实验时用 Krebs 液或无钙 Krebs液配制成所需浓度的溶液。1.5 实验内容与方法1.5.1 离体结肠平滑肌标本制备 参照文献方法6。将大鼠用木棒击头致昏后，迅速沿腹中线打开腹腔，于距肛门 38 cm 处剪取一段结肠，放入盛有 4 Krebs液、底部铺有硅胶的培养皿中，并持续通以 95 O25 CO2 的混合气体。用眼科剪小心去除肠管上的附带组织后，沿肠系膜一侧剪开洗净，黏膜层朝上固定在培养皿底部。用精细镊子将黏膜层及黏膜下层组织剥除，得到完整的平滑肌片。沿纵行肌纤维的走向剪成 2 mm8 mm 的肌条
11、标本，并在肌条两端分别用 5 0 号医用丝线扎牢。将制备好的标本移入含有 37 Krebs 液并持续通以 95 O25 CO2 混合气体的恒温浴槽中，浴槽内溶液体积固定为 10 mL。标本一端固定在浴槽底部，另一端通过张力换能器与生理记录仪相连。标本的初始负荷为0.5 g。每 15 分钟更换一次新鲜的 Krebs 液，平衡 60 min 后开始实验。41.5.2 高钾引起的肌条收缩实验 每次实验时从同一只大鼠的结肠上剪取制备两个平滑肌标本，并分为痛泻要方组和空白对照组。标本平衡 60 min 后，浴槽内加入 100 mmol/L KCl（终浓度，下同）引起肌条收缩。待收缩反应稳定后，痛泻要方组
12、按累积加药法加入用 Krebs 液配制的痛泻要方溶液，使浴槽内的痛泻要方终浓度分别为 3、10、30、100、300、1 000、3 000、10 000 g/mL（生药浓度，下同），每 5 分钟增加一个浓度。以加药前后张力变化（加痛泻要方后的张力值基础张力值）/（加痛泻要方前的张力值基础张力值）所得的百分数作为观测指标，观察痛泻要方对 KCl 引起的肌条收缩的抑制作用。空白对照组用同体积的 Krebs 液代替痛泻要方溶液，其余操作与痛泻要方组相同，并取对应时间的张力值仿照痛泻要方组的计算方法得到百分数。以上实验用 6 只不同的大鼠重复 6 次。1.5.3 细胞内钙库耗竭后细胞外 Ca2+内流
13、引起的肌条收缩实验 每次实验时从同一只大鼠的结肠上剪取制备两个平滑肌标本，并分为痛泻要方组和空白对照组。标本平衡 60 min 后，将 Krebs 液换成无钙 Krebs 液，并加入 1 mol/L thapsigargin和 1 mmol/L EGTA 孵育 30 min 以耗竭平滑肌细胞内钙库中的 Ca2+，随后将溶液置换为 2.5 mmol/L Krebs 液引起肌条收缩。待收缩反应稳定后，痛泻要方组按累积加药法加入用 Krebs 液配制的痛泻要方溶液，加药和取值计算方法同 1.5.1。空白对照组用同体积的 Krebs 液代替痛泻要方溶液，其余操作与痛泻要方组相同。以上实验用 6 只不同
14、的大鼠重复 6 次。1.5.4 ACh 引起的肌条收缩实验 每次实验时从同一只大鼠的结肠上剪取制备4 个平滑肌标本，并分为小、中、大剂量痛泻要方组和空白对照组。标本平衡 60 min 后，在浴槽内加入 104 mol/L ACh 引起肌条收缩，10 min 后洗脱，重新平衡5至肌条张力恢复到基线水平并出现稳定的自发节律后，小、中、大剂量痛泻要方组分别加入 Krebs 液配制的浓度为 300、1 000、3 000 g/mL 的痛泻要方溶液孵育 15 min；然后将 Krebs 液换成无钙 Krebs 液（连续用无钙 Krebs 液洗 3 次，并在最后一次洗后加入用无钙 Krebs 液配制的痛泻
15、要方溶液，浓度与换液前相同），随即再次加入 104 mol/L ACh，此时引起肌条瞬时收缩，为第一时相，是依赖于内钙的释放；待收缩消失后加入原水平（1.2 mmol/L）的 Ca2+又可引起肌条持续性收缩，为第二时相，是外钙内流的结果。取第 1 次 ACh 增加的张力值作为参照值，取第 2次 ACh 在无钙 Krebs 液中增加的张力值（第一时相）和复钙后增加的张力值（第二时相）分别作为效应值，以效应值/参照值所得的百分数作为观察指标，观察痛泻要方对 ACh 引起两个收缩时相的影响。空白对照组分别用同体积的 Krebs 液和无钙 Krebs 液代替痛泻要方溶液，其余操作与痛泻要方组相同。以上
16、实验用 6 只不同的大鼠重复 6 次。1.6 统计学方法 计量资料数据以 xs 表示。运用 GraphPad Prism 4 软件对数据进行统计分析、作图。两组数据的比较采用 Student t 检验，多组数据间比较采用单因素方差分析进行检验，P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 痛泻要方对高钾引起的肌条收缩的影响 100 mmol/L KCl 引起肌条张力增高，且能维持在一较稳定水平，加 Krebs 液后无明显变化。痛泻要方浓度依赖性地降低 KCl 增加的肌条张力，当浓度加至 1 000 g/mL 时，痛泻要方组的肌条张力下降水平与对照组比较，差异有统计学意义（P0.01）。在痛泻要方浓度为 10 000 g/mL 时，肌条张力降至加痛泻要方前的 35左右。说明痛泻要方能抑制6KCl 引起的肌条收缩。见图 1。2.2 痛泻要方对细胞内钙库耗竭后细胞外 Ca2+内流引起的肌条收缩的影响 细胞内钙库耗竭后，外钙内流引起的肌条收缩表现为较稳定的张力增加，增加的
