1金刚烷胺和奥司他韦体外抗 H5N1 亚型禽 流感病毒的作用作者：刘丽华 朱翔 张宇锋 温景芸 张永标 冼盈 林潮双 廖明 辛朝安 张扣兴【摘要】 【目的】 观察体外单用金刚烷胺、奥司他韦及两药联合使用对两株 H5N1亚型的禽流感病毒分离株(AIV127、AIV174)的抑制作用，了解广东地区分离的不同 H5N1 毒株之间药物敏感性的差异，为临床合理应用抗病毒药物提供科学依据方法】 建立体外 H5N1 感染模型，根据药物与病毒、细胞的不同作用，通过 3 种给药方式，使用细胞病变(CPE)、组织培养半数感染量(TCID50)评估抗病毒药物对 H5N1 的体外抑制作用 【结果】 三种给药方式金刚烷胺联合奥司他韦，均比单用金刚烷胺体外抑制 AIV127 及 AIV174 效果明显(P 0.01);而仅在治疗给药方式，两者联合比单用奥司他韦效果明显(P 0.01)三种给药方式金刚烷胺、奥司他韦及联合用药对同一亚型 H5N1 AIV127 比 AIV174 毒株均较敏感(P 0.01) 【结论】 抗病毒药物对不同的禽流感病毒毒株之间敏感性存在差异，应根据不同毒株给予相应的抗病毒治疗 【关键词】 药物; 禽流感病毒; H5N1 亚型; 抗病毒活性Abstract： 【Objective】 To observe inhibition of Amantadine， Oseltamivir and double combination on H5N1 in vitro and further investigate antiviral activity of drugs against H5N1 isolated locally. 【Methods】 Cytopathic effect (CPE)， hemagglutinin (HA) titers and TCID50 of virus were applied to observe the antiviral activity of H5N1 (AIV 174 and AIV 127) with three different medications， including treated， prophylactic medications and drugs affected H5N1 directly. 【Results】 The inhibition of conbination is better than amantadine alone for H5N1(AIV 174 and AIV 127) with three medications(P 0.01) whereas the combination is better than Oseltamivir only 2through treated medication (P 0.01). Inhibition of Amantadine， Oseltamivir alone and double combination for AIV127 was more sensitive to AIV174 through three medications (P 0.01). 【Conclusions】 Sensitivity of antiviral drugs differs from different avian influenza strains， corresponding antiviral treatments should be given according to different viral strains locally in clinic.2003 年至 2009 年，全世界累计人感染 H5N1 病例共 423 例，其中死亡 248 例[1]。
鉴于禽流感对家禽业及人类的致命性危害，对抗其最基本的策略有人工免疫和抗病毒药物然而，病毒表面蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)连续变异严重影响了疫苗的有效性[2]因此，抗病毒药物成为控制流感大流行的关键因素目前，获批有效防治流感病毒的抗病毒药物有两类，M2 离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitors， NAI)前者的缺点为不良反应大，短时间内可出现药物耐药性，并且对 B 型流感病毒无效[3-4]而 NAI 较昂贵，但对 A、B 型流感病毒均有效，不良反应小，且可以减少药物耐药性的出现[5-6]据报道，目前在美国几乎所有流行的甲型流感病毒株，对金刚烷胺或者奥司他韦均出现一定程度的耐药性[7]因此，甲型流感病毒因病毒变异及两类主要抗病毒药物使用诱导毒株耐药，已成为全球关注的焦点问题联合两类抗病毒药物，相对单药具有更高的治疗效价，同时还能减少单药使用时耐药毒株的出现[8]本实验观察了体外单用及联合使用两类抗病毒药物对 H5N1 的抗病毒作用，旨在了解广东地区分离的 H5N1 的药物敏感性情况及不同毒株之间药物敏感性的差异，比较体外联用两类抗病毒药物及单用时抑制 H5N1 的作用。
1 材料与方法1.1 药 物金刚烷胺：江苏鹏鹞药业有限公司，批号：0507271金刚烷胺储存液：将金刚烷3胺用灭菌蒸馏水配成 10 mg/mL， 4 ℃保存备用磷酸奥司他韦胶囊：瑞士巴塞尔蒙夫迈罗氏有限公司生产，上海罗氏制药有限公司分装产品批号：B1044，分装批号：SH0024奥司他韦储存液：将奥司他韦用 DMSO 稀释成 10 mg/mL， 4 ℃保存备用1.2 病 毒H5N1 亚型 HPAIV127 及 174 株由华南农业大学禽病研究室惠赠，分离、纯化和保存对于 HPAIV H5N1 亚型病毒被获准在华南农业大学禽病教研室BSL3(Biosafety level 3)实验室操作1.3 细 胞幼犬肾(madin-darby canine kidney， MDCK)细胞由华南农业大学禽病研究室惠赠、保存细胞营养液：用 Dulbecco?蒺 s MEM，GIBCO BRL 配制，含 100 mL/L小牛血清，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素细胞维持液：含 20 mL/L 小牛血清的 Dulbecco?蒺 s MEM，其余同营养液1.4 H5N1 亚型 AIV 病毒毒力的测定将病毒悬液用细胞维持液做 10 倍稀释为 10-1 到 10-11 共 8 个稀释度，加入MDCK 细胞已长成单层的 96 孔板中，每孔 200 μL，37 ℃，5%体积分数 CO2 培养箱中孵育。
同时设正常细胞对照组倒置显微镜下每天观察细胞病变效应(cytopathic effect， CPE)按 Reed-Muench 法计算组织培养半数感染量 TCID50[9](tissue culture infectious dose 50)抗病毒实验时用 100 TCID50 的病毒量用于细胞实验41.5 药物对 MDCK 细胞毒性的测定用细胞维持液将 3 组药物(金刚烷胺组、奥司他韦组及二者联合组)作 21 ～ 29 倍比稀释，将 MDCK 分别加入到已长成细胞单层的 96 孔板中，同时设立正常对照将细胞培养板置 37 ℃、5%体积分数 CO2 培养箱中培养 4 d，每天 2 次用倒置显微镜观察细胞生长情况最终以能维持细胞正常生长的最高稀释浓度作为该药物对细胞的安全浓度并按 Reed-Muench 法计算最大无毒浓度 TD0，并以 TD0作为细胞实验时的药物起始浓度1.6 金刚烷胺、奥司他韦及二者联用体外对 H5N1 的影响药物浓度的设置：3 组药物从 TD0 开始对倍稀释共 10 个浓度每一浓度 4 孔，每孔 50 μL同时设正常对照及病毒对照组待 96 孔板中的 MDCK 细胞基本长成单层时，根据药物、病毒、细胞作用的 3 种不同方式，实验分 3 组：1.6.1 药物对病毒的治疗作用采用治疗给药方式，即细胞先感染病毒后加药物，探讨药物对细胞内病毒复制的抑制作用。
取已长成单层细胞的 96 孔板，每孔分别接种的病毒液 50 μL，置 37 ℃、5%体积分数 CO2 培养箱中 1 h，弃病毒液，然后分别加入安全浓度的 3 组药物及维持液作 2 倍稀释的相应稀释度的药液 50 μL /孔每 12 h 观察细胞生长情况，同时设置病毒对照组及正常对照组观察实验结果后，将各孔细胞反复冻融 3次，使细胞裂解，病毒释放，同一药物浓度 4 孔合并，5 000 r/min (r = 15 cm)离心15 min，按 Reed-Muench 法计算 TCID5051.6.2 药物与病毒的直接作用采用直接作用给药方式，即药物与病毒先作用一段时间再感染细胞，探讨药物对病毒的直接杀伤作用将 100 倍 TCID50 病毒液 50 μL 分别与等量不同浓度的3 组药物混合，然后接种于 96 孔板中，同一浓度 4 个孔每 12 h 观察细胞生长情况其余操作同 1.6.11.6.3 药物对病毒的预防作用d45 采用预防给药方式，即细胞先与药物作用一段时间后再感染病毒，探讨药物对病毒感染细胞的阻断作用先将各浓度 3 组药物每孔 50 μL，加入已长成单层细胞的 96 孔板中，后每孔加入维持液稀释浓度为 100 TCID50 的病毒液 50 μL，于 37 ℃，5%体积分数 CO2 培养箱中吸附 1 h 感染细胞，观察细胞病变。
其余操作同 1.6.11.7 观察指标细胞病变效应(CPE)的观察标准见文献[9]，MDCK 细胞内 AIV 的 TCID50 测定见文献[10]1.8 数据分析药物、给药方法之间比较采用双因素方差分析，组内药物浓度的比较用单因素方差分析，P 0.05 为差异有统计学意义 2 结 果2.1 半数感染量按 Reed-Muench 法计算半数感染量(TCID50)，AIV127 株的 TCID50 =10-6.5 6/0.2 mL，AIV174 株的 TCID50 = 10-6.75 /0.2 mL2.2 最大无毒浓度根据细胞病变(CPE)得出最大无毒浓度(TD0)，金刚烷胺为 2-5 × 10 g/L 即 0.31 g/L，奥司他韦为 2-6 × 10 g/L 即 0.16 g/L，联合组为 2-6 × 10 g/L 即 0.16 g/L3 组药物浓度在 TD0 以上有不同程度地变形肿胀，圆缩脱落，而浓度在 TD0 以下无明显 CPE 出现2.3 抗病毒药物体外对 H5N1 的影响2.3.1 抗病毒药物体外对 H5N1 的治疗作用对于 AIV127 毒株：与病毒对照组相比， 2-13 × 10 g/L 的金刚烷胺，2-15 × 10 g/L 的奥司他韦及联合组，其 log10 TCID50 值比较 P 0.05，提示单用奥司他韦及联合用药在此药物浓度均能有效抑制 MDCK 内病毒的增殖。
对于 AIV174 毒株：与病毒对照组相比，2-8 × 10 g/L 的金刚烷胺，2-13 × 10 g/L 的奥司他韦，2-15 × 10 g/L 的联合组，其 log10 TCID50 值比较 P 0.053 组抗病毒药物体外抑制MDCK 内 H5N1 的复制，差异有统计学意义(P 0.01)，其中奥司他韦抑制MDCK 内病毒复制效果较金刚烷胺明显，联合组比单用金刚烷胺或奥司他韦抑制 MDCK 内 H5N1 病毒复制效果明显(图 1)2.3.2 抗病毒药物体外直接杀伤 H5N1 的作用对于 AIV127 株：与病毒对照组相比，2-13 × 10 g/L 的金刚烷胺，2-15 × 10 g/L的奥司他韦及联合组其 log10 TCID50 值比较 P 0.05，提示此药物浓度能有效7地直接杀伤 H5N1对于 AIV174 株：与病毒对照组相比，2-14 × 10 g/L 的金刚烷胺，2-1。