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1、1氧化低密度脂蛋白刺激人冠状动脉内皮 细胞可诱导共刺激分子配体的表达作者：徐琳, 李志梁, 朱肖星, 马骏, 洪长江, 何建新, 向定成, 潘春梅, 邱健【摘要】 目的: 探讨氧化低密度脂蛋白(ox LDL)对人冠状动脉内皮细胞表达可诱导共刺激分子配体(ICOSL)的影响。方法: 以人冠状动脉内皮细胞为研究对象, 通过间接免疫荧光、 逆转录聚合酶链反应(RT PCR)和 Western blot 等方法, 观察ICOSL 在人冠状动脉内皮细胞的表达及 ox LDL 的干预作用。结果: 对照组和ox LDL 刺激组 ICOSL mRNA 的平均光密度 OD 值分别为 0.0710.035 和0.
2、1860.044(n=6), ICOSL Western blot 吸光度 A 值分别为 10.881.53 和16.034.08(n=6), ox LDL(100 mg/L)可增加 ICOSL 在人冠状动脉内皮细胞中mRNA 和蛋白的表达, 并具有统计学意义(P0.05)。结论: ox LDL 可上调人冠状动脉内皮细胞表达 ICOSL。 【关键词】 ICOSL; ox LDL; 冠状动脉内皮细胞; 动脉粥样硬化; 免疫Abstract AIM: To study the expression of inducible co stimulator ligand(ICOSL) on human
3、coronary artery endothelial cells(HCAEC) and its being interferentialed by oxidized low density lipoprotein(ox LDL). METHODS: ICOSL expression levels were determined by the fluorescence, reverse transcription PCR (RT PCR) and Western blot, respectively. RESULTS: The ICOSL mRNA OD values of control a
4、nd 100 mg/L ox LDL group was 0.0710.035 and 0.1860.044, respectively. The Western blot A values of control and 100 mg/L ox LDL group was 10.881.53 and 16.034.08, respectively. ox LDL increased expression of ICOSL mRNA and protein(P0.05). CONCLUSION: ICOSL can express on the HCAEC. ox LDL can up regu
5、late the expression of ICOSL.Keywordsinducible co stimulator ligand; oxidized low density lipoprotein; human coronary artery endothelial cells; atherosclerosis; immune2动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)作为一个慢性炎症反应的理论已被广泛接受, 新近研究发现, 在 AS 发生发展的整个进程中都有免疫反应的参与, 通过免疫调节治疗 AS 正在成为人们关注的热点1。可诱导共刺激分子配体(inducible co s
6、timulator ligand, ICOSL)是新近发现的 B7 家族成员, 主要在活化的 B 细胞、 肥大细胞、 部分活化的单核细胞、 成纤维细胞、 肾小管上皮细胞和造血母细胞上表达, ICOSL ICOS 这一对共刺激信号在抗原呈递和自身免疫性疾病中起重要作用, 并参与了 AS 的进程2。冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells, HCAEC)既是内分泌组织又是激素反应组织, 与血管壁炎症、 动脉硬化的发生和发展密切相关。氧化低密度脂蛋白(oxidation low density lipoprotein, ox LDL)可分泌致
7、AS 的细胞因子和炎症因子, 还是 AS 细胞免疫反应中最主要的自身抗原3。本研究中以 HCAEC 为研究对象, 观察公认的具有致AS 作用的 ox LDL 对 ICOSL 表达的影响, 为 AS 的免疫学发病机制提供新的思路和实验依据。1 材料和方法1.1 材料 RPMI1640 培养基(Gibco, USA), HCAECc 12221 细胞株(Science Cell 公司), 羊抗人 ICOSL mAb(Santa Cruz Biotechnology 公司), ox LDL(北京协和三友科技有限公司)。ICOSL 和 GAPDH(作为内参)引物由英俊公司设计合成, TRIgol 试剂
8、盒和 RT PCR 试剂盒分别为 BilFlux 和 TaKaRa 公司产品, 其余试剂为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 人冠状动脉内皮细胞的培养与鉴定 复苏 HCAEC, 调节细胞密度为33109/L, 用含 100 mL/L 胎牛血清 RPMI1640 培养液培养, 接种于 24 孔培养板, 细胞长至 70%80%时换用无血清培养液 24 h, 换液后即可用于实验。内皮细胞鉴定采用因子相关抗原, 按 S P 免疫组化试剂盒说明书操作。倒置相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石状生长, 有接触抑制现象。胞质着色者为阳性细胞。细胞纯度99%, 台盼蓝染色细胞活力大于 97%。1.2.2 实验分组 实
9、验分为 2 组, 空白对照组和 100 mg/L ox LDL 组。1.2.3 间接免疫荧光检测 ICOSL 的表达 制备 HCAEC 爬片, 固定液(含 20 g/L多聚甲醛和 1 mL/L TRIton X 100)室温固定 30 min, PBS 洗 2 次, 以 150 PBS(pH7.2)稀释的正常羊血清封闭 20 min, PBS 洗 3 次, 每次 12 min, 滴加 0.1 mol/L PBS(pH 7.2)1100 稀释的 ICOSL 的羊单克隆抗体, 37孵育 30 min, PBS洗 5 次, 每次 2 min, 加入 FITC 标记的兔抗羊二抗, 避光, 4下孵育 3
10、0 min, PBS洗 3 次, 荧光显微镜下观察, 摄影。1.2.4 RT PCR 检测人冠状动脉内皮细胞 ICOSL 及 GADPH 看家基因的表达 以 TRIzol 试剂盒抽提 HCAEC 总 RNA, DU530 紫外分光光度仪(Beckman 公司)测定样本总 RNA 含量。采用一步法 RT PCR 试剂盒进行 ICOSL 基因和 GADPH看家基因表达检测, 反应体系和条件按试剂盒说明书进行。用于 ICOSL 基因RT PCR 的引物序列为: 5 AGGAAGTCAGAGCGATGGTAG 3(上游引物序列),5 AGGCTGTTGTCCGTCTTATTG 3(下游引物序列), 目
11、的片段 469 bp。用于GADPH 看家基因 RT PCR 的引物序列为: 5 CGACCA CTTTGTCAAGCTCA 3(上游引物序列), 5 AGGGTCTACATGGCAACTG 3(下游引物序列), 目的片段 240 bp。反应结束后, 取反应产物 10 L 进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色, UVP 型凝4胶图像分析系统摄图, 并分析各组目的基因及 GAPDH 基因平均光密度值(OD), 以二者的比值代表 ICOSL 的表达。以 PCR 产物为模板, 用 ICOSL 特异引物作为测序引物置 ABI 3730 型测序仪进行序列测定, 并将所得的测序结果与 Gen
12、Bank数据库进行 BLAST 同源性比较。ICOSL 序列比较使用 NCBI 网站提供的 BLAST程序。1.2.5 Western blot 检测人冠状动脉内皮细胞 ICOSL 蛋白的表达 收获细胞21010/L, PBS 洗 2 次, 提取膜蛋白后, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上, 在 PBST 洗涤缓冲液中轻轻摇动, 洗涤 15 min。加入一抗, 室温孵育 1 h, PBST 洗膜 3 次。加入二抗, 孵育 1 h, PBST 洗膜 3 次。ECL 液染色, 曝光, 化学发光凝胶成像分析系统成像, 分析各组目的条带及 GAPDH 的吸光度值(A), 以二者的
13、比值代表 ICOSL 蛋白表达。1.2.6 统计学分析 所有实验结果以 xs 表示, 两因素比较采用析因方差分析, 组间差异比较采用 one way ANOVA, 多重比较采用 LSD(least significant digit)法, 所有统计学处理均采用 SPSS 11.0 统计软件进行分析。P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 ICOSL 在人冠状动脉内皮细胞的表达 荧光显微镜下, 可见 ICOSL 表达于 HCAEC 表面, 呈绿色荧光。RT PCR 结果显示可见 ICOSL 的 mRNA 扩增产物片段位于相当与 Mr 469 的位置, 与预期理论值大小一致(图 1A),
14、 产物特异, 条带清晰, 经测序与基因库中人 ICOSL 基因序列完全吻合(结果略)。HCAEC 表达ICOSL 蛋白水平, 通过 Western blot 显示 ICOSL 的蛋白约为 Mr 70 000, 与理论5值基本一致(图 1B)。2.2 ox LDL 对 HCAEC 表达 ICOSL mRNA 和蛋白水平的影响 RT PCR 及Western blot 结果显示: ox LDL 刺激组 ICOSL 的平均光密度 OD 值和吸光度 A值均分别高于对照组, ox LDL 可增加 ICOSL 在 HCAEC 中的 mRNA 和蛋白表达, 并具有统计学意义(P0.05, 图 2、 3)。
15、.3 讨论自 20 世纪 80 年代开始的一系列研究发现, 参与动脉粥样斑块形成过程的细胞和分子都是那些参与炎症反应的细胞和分子, 从而炎症理论得到了完善4。随着对 AS 研究的深入, 越来越多的证据显示 AS 不但具有慢性炎症的特征, 而且炎症反应的起始与持续都有先天性和获得性免疫应答的参与, 免疫介导在 AS 的发生机制和心血管触发事件发生中起重要作用, 其中 T 细胞活化是核心环节4。业已证实, T 细胞活化依赖双重信号: 抗原刺激和共刺激信号, 且后者更为重要。ICOSL 属于 B7 家族的新成员, 为一个由 309 个氨基酸组成的型跨膜糖蛋白, 大小约 63 00072 000, 它
16、与可诱导共刺激分子(inducible co stimulator, ICOS)的基因突变或表达异常与某些炎症反应及自身免疫性疾病的发生密切相关。文献报道, ICOSL ICOS 这一对配体 受体参与了 AS 的发生和发展2。本研究应用 3种方法, 从定性到定量, 不仅在形态上(荧光显微镜下), 而且在 mRNA 分子水平(RT PCR)和蛋白质水平(Western blot)证实 ICOSL 表达在 HCAEC 的细胞膜上, 这为研究 ICOS ICOSL 共刺激途径与 AS 免疫病理过程的关系提供了直接依据和实验基础。血中 ox LDL 浓度升高是 AS 发展的独立的危险因素, ox LDL 是炎症反应的强效诱导剂, 在破裂的斑块脂质核心中非常丰富。体外试验表明, ox LDL 可损伤内皮细胞表面层糖萼, 导致血管内皮细胞黏附能力增强, 使血液6中的单核细胞易于黏附于 EC 表面, 也可诱导血管内皮细胞及单核 巨噬细胞表达黏附分子、 趋化性细胞因子、 促炎因子及其他炎症反
