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1、1液相色谱串联质谱测定面条和米粉中 的硫脲作者：黄晓兰 罗辉泰 吴惠勤 陈文锐 邹志飞 黄芳 林晓珊 朱志鑫【摘要】 建立了米面制品中硫脲的液相色谱 串联质谱(LC MS/MS)测定方法。实验优化了样品提取方法、液相色谱条件和质谱参数。样品用 80%乙醇超声波提取，离子交换色谱分离，色谱柱为 NUCLEOSIL 100 5SA 阳离子交换柱，流动相为乙腈 (1%乙酸+0.2%乙酸铵)水溶液(3070)，流速 0.5mL/min。采用电喷雾质谱正离子模式电离，多反应选择离子检测，检测离子对为 m/z 77/60 和 m/z 77/43，其中m/z 77/60 为定量离子对。结果表明: 本方法简便
2、快速、准确可靠，相对标准偏差4.0%;回收率为 83%90%;检出限为 0.5 mg/kg;定量下限为 5 mg/kg。 【关键词】 硫脲， 液相色谱， 串联质谱， 面条， 米粉1 引 言硫脲(thiourea)又称硫代尿素，是一种纺织品的化学漂白剂，曾一度作为防腐剂，广泛用于各类需要漂白、保鲜防腐的食品。向食品中加入硫脲可阻止褐变，表观光亮，略带半透明。硫脲被人体摄入后危害健康，抑制甲状腺和造血器官的机能，引起中枢神经麻痹及呼吸和心脏功能降低等，甚至导致死亡。由于硫脲毒性大，我国已不允许其作为食品添加剂使用。近年有报道，我国东南沿海曾有用硫脲作为面条的增白剂、增筋剂，而目前我国尚无食品中硫脲
3、测定的相关标准方法。在当今食品安全问题严峻的状况下，迫切需要尽快建立其检测方法。目前，空气、水、土壤和生物等材料中硫脲的检测方法已有报道14 ，通常2采用高效液相色谱法;Raffaelli 等5报道了用大气压化学电离质谱法测定废水中的硫脲。但至今未见食品中硫脲检测的相关报道。由于食品基质复杂，采用液相色谱法干扰很大，且灵敏度较低。本研究采用液相色谱 串联质谱(LC MS/MS)法检测面条和米粉中的硫脲，考察了样品的提取方法，优化了色谱条件和质谱条件。本方法简便快速、准确可靠，检出限为 0.5 mg/kg;定量下限为 5 mg/kg，适用于面条、米粉等米面制品中硫脲的测定。2 实验部分2.1 仪
4、器与试剂Agilent 1200LC/6410B MS 液相色谱/串联四级杆质谱联用仪;AS 3120 超声波发生器(Auto Science 公司)， 功率 250 W，频率 33 kHz。硫脲(Thiourea，纯度98.0%);硫脲标准溶液的配制：以水为溶剂配制质量浓度为 1000 mg/L 的标准溶液，经 0.22 m 滤膜过滤后作为储备液。使用时用水逐级稀释至所需浓度;乙腈和甲醇(HPLC 级);乙酸、乙酸胺、乙醇等(分析纯，广州化学试剂厂);实验用水为二次蒸馏水。2.2 样品预处理将样品用粉碎机粉碎，取 2.0 g 粉碎后的样品置于具塞三角瓶中，加入 20.0 mL 80%乙醇溶液
5、，盖上盖，超声波振荡提取 15 min，将超声波提取后的样品混合物全部转移至离心管中，以 3500 r/min 离心 15 min。移取上清液 10.0 mL 至 50 mL 烧杯中，在 68 水浴上浓缩至约 1 mL。然后转移至 5 mL 刻度试管中，用水3洗涤烧杯多次，洗涤液合并入 1.0 mL 刻度的梨形瓶中，在 50 下吹氮浓缩定容至 1.0 mL。2.3 LC MS/MS 测定2.3.1 HPLC 条件 色谱柱：NUCLEOSIL 100 5SA 阳离子交换柱(250 mm4.6 mm， 5 m); 流动相：乙腈 (1% 乙酸+0.2% 乙酸铵)水溶液(3070, V/V)，流速0.
6、5 mL/min。进样量 5.0 L。2.3.2 质谱条件 电喷雾(ESI)正离子电离模式。干燥气(N2)温度 350 ;雾化气(N2)压力 276 kPa;干燥气(N2)流量 9.00 L/min;电喷雾电压 4000 V;检测离子对为 m/z 77/60 和 m/z 77/43，其中 m/z 77/60 为定量离子对;采集时间 200 ms;碎裂电压 80 V;碰撞能量 36 V(m/z 77/60)和 48 V(m/z 77/43)。2.3.3 测定方法 取样品溶液和标准溶液各 5.0 L 注入液相色谱 串联四级杆质谱仪进行分析，以其标准溶液峰的保留时间和质谱检测离子对 m/z 77/6
7、0 和 m/z 77/43 为依据进行定性分析，以定量离子对 m/z 77/60 的峰面积计算样品中硫脲的含量。3 结果与讨论3.1 液相色谱条件的优化考察了 C18 柱、C8 柱、NH2 键合相柱及阳离子交换柱对硫脲分离的影响。结果表明：采用 C18 色谱柱时，当流动相为乙腈 水体系时4，硫脲几乎无保留;当乙腈比例降低至 10%时，硫脲仅有少许保留，保留时间为 2.7 min(色谱柱规格为250 mm4.6 mm，流速为 1.0 mL/min，下同);当在流动相中添加庚烷磺酸盐离子对4试剂时，硫脲的保留时间并无明显增加。采用 C8 色谱柱时，当流动相为乙腈 庚烷磺酸盐体系时，随着乙腈比例从
8、65%，40%至 5%逐渐减少，硫脲的保留时间从2.9 min， 3.0 min 至 3.3 min 逐步增加，但保留时间仍太短。采用 NH2 键合相色谱柱时，当流动相为乙腈 水体系时，随着乙腈比例依次从 70%， 80%， 90%增加到 100%，硫脲的保留时间也从 3.47 min， 3.55 min， 3.65 min 延长到 3.79 min，但增加幅度不大，保留时间较短，且峰形较宽。采用阳离子交换色谱柱时，当流动相为乙腈 磷酸盐缓冲液和乙腈 乙酸铵缓冲液体系时，乙腈比例为 30%时，硫脲的保留时间为 3.4 min，峰形较理想;随着乙腈比例的减少，硫脲的保留时间虽逐步增加，但增加幅度
9、不大且色谱峰展宽严重;改变缓冲液的浓度和 pH 值，硫脲的保留时间并无明显改变。以上实验表明，硫脲由于相对分子质量很小，极性较强，在各类型的色谱柱上保留时间均较小，用液相色谱紫外检测法测定实际样品时受到的干扰较严重。因此采用液相色谱 串联质谱法测定。考虑到质谱法测定不能使用离子对试剂、磷酸盐缓冲液作流动相，并综合考虑保留时间和色谱峰形，故选择阳离子交换色谱柱和乙腈 乙酸铵缓冲液体系。经实验本方法最终选择的色谱柱为 NUCLEOSIL 100 5SA 阳离子交换柱(250 mm4.6 mm， 5 m)，流动相为乙腈 (1%乙酸+0.2%乙酸铵)水溶液(3070，V/V)，流速 0.5 mL/mi
10、n。此条件下硫脲的保留时间为 6.7 min，峰形较好。 3.2 质谱参数的优化用 0.5 mg/L 硫脲标准溶液，采用 ESI 正离子模式进行一级质谱扫描，得到硫脲准分子离子峰 m/z 77，即M+H+。以 m/z 77 为母离子作二级质谱，得到硫脲碎片离子峰 m/z 60 和 43，即M+H-NH3+和M+H-H2S+。选择 m/z 77/60 和 m/z 577/43 离子对进行 MRM 模式检测，并对各质谱参数进行优化。优化后的质谱条件见 2.3.2 节。硫脲的(+)ESI 二级质谱图见图 1。优化后的硫脲标准溶液的HPLC MS/MS 色谱图见图 2。3.3 样品前处理条件的优化3.
11、3.1 不同提取剂对硫脲提取效果的影响 比较了用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水作提取剂的提取效果。在 2.0 g 粉碎后的面条样品中加入 11.6 mg/L 硫脲标准溶液 1.0 mL，待溶液完全被样品吸收后，再分别用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水进行超声波振荡提取。按前述 LC MS/MS 方法测定硫脲的提取效率。结果表明，氯仿几乎无法提取出硫脲，甲醇、乙醇、乙腈和水的提取效率分别为 86.5%， 70.0%， 67.1%和 88.3%，可见以水作提取剂的效率最高。但用水提取时，样品中的淀粉及其它添加剂也会被提取出来，导致提取液混浊且粘稠，后续处理很麻烦;而用甲醇和乙醇提取虽然效率略低，但提取液较干
12、净，处理过程简便快捷。因此结合二者的优点，考虑用甲醇或乙醇和水的混合溶剂进行提取。分别考察了甲醇比例为 20%80%时的提取效果和乙醇比例为 20%80%时的提取效果，结果见表1。由表 1 可见，80%乙醇 水混合溶剂的提取效果最佳。表 1 不同比例的醇和水对硫脲的提取效果3.3.2 提取时间对硫脲提取效果的影响 考察了超声波提取 10， 15， 20， 25和 30 min 时的提取效果，其回收率分别为 87.3%， 88.1%， 86.3%， 85.6%和85.8%。可见超声波提取时间对硫脲的提取效果影响不明显，超声 10 min 后提取率已基本稳定。本实验选择超声波提取时间为 15 mi
13、n，可满足分析要求。6综合以上结果，确定样品的最佳前处理条件为 2.2 节所述。由于采用 MRM 方式测定，避免了样品基体杂质的干扰，故样品提取后无需净化即可直接上机分析，简便快速，回收率较高。3.4 线性范围、线性方程与检出限取硫脲标准储备液逐级稀释成 0.501，1.002，2.004，5.01，10.02 和 20.04 mg/L的系列标准溶液，进行 LC MS/MS 分析。以峰面积(A)和质量浓度(，mg/L)作定量工作曲线，线性方程为 A=1209-30.91，相关系数为 0.9999，在 0.520 mg/L 浓度范围内线性关系良好。当样品中的硫脲超过此线性范围时，可适当加大样品的
14、稀释倍数。以信噪比 S/N=3 确定样品的检出限为 0.5 mg/kg，采用标准添加法进行实测确定硫脲的定量下限为 5.0 mg/kg，可满足米面制品中对硫脲的检测要求。3.5 回收率和精密度取不含硫脲的面条和米粉样品各 3 组，分别加入 5.01，10.02 和 50.10 mg/kg 硫脲标准溶液，待完全被样品吸收后，按实验方法测定硫脲的回收率，每组样品平行测定 6 次，结果见表 2。由表 2 可见，面条样品中硫脲在添加水平 550 mg/kg，其回收率为 83%89%，相对标准偏差为 0.8%4.0%;米粉样品中硫脲在添加水平550 mg/kg，其回收率为 88%90%，相对标准偏差为
15、1.7%3.3%。面条空白及加标样品的 HPLC MS/MS 总离子流色谱图见图 3a 和 b。本方法回收率较难达到 90%以上，可能是基质表 2 标准加入样品中硫脲的回收率和相对标准偏差【参考文献】1 Stuttgart, Hirzel S, BUA (1995) Thiourea. German Chemical Society (GDCh) Advisory Committee on Existing Chemicals of Environmental Relevance (BUA). Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft(BUA Report 1
16、79)72 Hashimoto A. Anal. Chem., 1979, 51(3): 3853873 Kobayashi H, Matano O, Goto S. Journal of Chromatography, 1981， 207: 2812854 Aulakh J S, Sharma V K, Mahajan R K, Malik A K. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 2004, 3(5): 7517575 Raffaelli A, Pucci S, Lazzaroni R, Salvadori P. Rapid Commun Mass Spectrom, 1997, 11: 259264
