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1、1电针对慢性癫痫大鼠海马新生神经元生 长抑素表达的影响【摘要】 目的 探讨电针对慢性癫痫大鼠海马新生神经元生长抑素(SS)表达的影响。方法 应用免疫荧光双标记和激光共聚焦显微镜观察了电针慢性癫痫大鼠督脉穴位“大椎”与“百会”后海马新生神经元生长抑素的表达情况。结果 海马新生神经元有 SS 的表达，且电针后的癫痫大鼠表达比未电针的癫痫大鼠减少，差异有统计学意义(P0.05)。结论 电针可抑制海马新生神经元 SS 的表达，而 SS 有致痫作用。由此推测电针的抑痫机制可能是通过海马新生神经元 SS 的表达而实现的。 【关键词】 癫痫；海马；新生神经元；电针；5-溴脱氧尿核苷；生长抑素ABSTRACT
2、: Objective To explore influence of electroacupuncture on somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of chronic epilepsy rats. Methods The double-label immunofluorescence with confocal microscope was used to observe somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of
3、chronic epilepsy rats after electroacupuncture stimulation of Dazhui (GV14) and Baihui (GV20) in DuMai. Results Somatostatin expression of newborn neurons was found in the hippocampus. Moreover, in somatostatin expression of newborn neurons, epileptic rats with electroacupuncture had less than epile
4、ptic rats in the hippocampus.The former had an obviously significant difference compared with the latter (P0.05). Conclusion Somatostatin is involved in proconvulsion. Electroacupuncture inhibits somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of chronic epilepsy rats. Electroacupunctu
5、re inhibits epileptogenesis by decreasing somatostatin colocalized with newborn neurons in hippocampus.KEY WORDS: epilepsy; hippocampus; newborn neuron; electroacupuncture (EA); BrdU (bromodeoxyuridine); somatostatin早在 20 世纪中期就有人报道，成年哺乳动物海马区能生成一定数量的新神经元。近年来随着神经干细胞研究的逐步深入以及 5-溴尿嘧啶核苷(5-bromo-deoxyurid
6、ine, BrdU)这一增殖细胞标记物的广泛应用，研究者发现成年海马区不但2确实存在可分化为神经元的增殖细胞，而且其数目远多于人们的想象。该部位神经干细胞微环境的改变将能阻抑或增强海马齿状回的神经发生。既往的研究已证实反复的痫性发作可引起海马新生神经元增加1-5，但这些新生神经元究竟有无功能及发挥哪种功能至今仍不清楚。许多研究表明，在各种癫痫动物模型的脑组织和癫痫患者病灶脑组织中生长抑素(somatostatin, SS)的含量有异常变化，提示 SS 可能参与了癫痫的发作过程。为此，本实验拟采用匹罗卡品诱导的癫痫持续状态(status epilepticus, SE)后慢性癫痫模型，一方面观察
7、了海马新生神经元是否有 SS 的表达，另一方面观察了电针干预后对海马新生神经元 SS 表达的影响，并探讨了电针对海马新生神经元影响的可能作用机制。1 材料与方法1.1 实验动物雄性 SD 大鼠 22 只，体重 180-200 g，由第四军医大学实验动物中心提供。动物饲养于 12-12 h(8:00-20:00)光暗环境，给予标准饲料及饮水。1.2 主要试剂盐酸匹罗卡品、小鼠抗 BrdU 抗体、兔抗 SS 抗体、FITC 标记的山羊抗小鼠抗体、Cy3 标记的驴抗兔抗体均购自 Sigma 公司；标记有丝分裂活动细胞的 BrdU 粉剂购自 Boehringer Mannheim 公司；氯化锂购自中国
8、医药集团上海试剂公司。1.3 主要仪器3恒冷冰冻切片机(美国)；激光共聚焦显微镜(Olympus FV300)；G6805 型电针仪(上海医用电子仪器厂)。1.4 方法1.4.1 锂-匹罗卡品癫痫模型的制作造模大鼠先腹腔注射新鲜配制的氯化锂，剂量为 3 mmol/kg，20 h 后腹腔注射盐酸匹罗卡品，剂量为 30 mg/kg。对照组大鼠注射等量的生理盐水。出现 SE 后 60 min 腹腔注射地西泮注射液(4 mg/kg)以终止 SE，降低死亡率。1.4.2 电针刺激参数及电针方法电针处理动物均在匹罗卡品或生理盐水处理后 3 d 时开始予以电针刺激，并连续刺激 28 d。电针刺激参数：电针督
9、脉穴位“大椎”与“百会”，取穴参考兽医针刺学6，采用疏密波。密波：6.25 Hz，1.8-4.9 mA，时间 2.08 s；疏波：3.85 Hz，1.4-2.0 mA，时间 1.28 s。持续 20 min。为了防止动物挣扎，在针刺前稍给乙醚麻醉，然后将动物固定于针刺操作台上，选用 1 寸毫针进行针刺， “百会”穴平刺， “大椎”穴斜向上刺，约 0.7 寸。1.4.3 实验动物分组癫痫组 8 只，均先腹腔注射新鲜配制的氯化锂(3 mmol/kg)，20 h 后腹腔注射盐酸匹罗卡品(30 mg/kg)，未行电针刺激；对照组 4 只，均注射等量的生理盐水，未行电针刺激；癫痫+电针组共 6 只，均先
10、腹腔注射新鲜配制的氯化锂(3 mmol/kg)，20 h 后腹腔注射盐酸匹罗卡品(30 mg/kg)，并行电针刺激；对照+电针组共 4 只，均注4射等量的生理盐水，并行电针刺激。1.4.4 BrdU 给药方法及标本制备7实验大鼠在匹罗卡品或生理盐水处理后 3 d 时分别腹腔注射 4 次 BrdU(50 mg/kg，溶解于 0.007 mol/L NaOH/生理盐水)，间隔 12 h 注射 1 次。所有实验大鼠均在最后一次注射 BrdU 后的 28 d 以戊巴比妥(50 mg/kg)深麻醉，先经升主动脉灌注生理盐水 100 mL，40 g/L 多聚甲醛液(pH 7.4)快速灌注 200 mL 后
11、，再慢速灌注 300 mL。取脑后，将脑组织入 40 g/L 多聚甲醛后固定过夜，再入 200 g/L 蔗糖4冰箱沉底。选择背侧海马部位应用恒冷冰冻切片机冠状位连续切片，脑片漂片厚 30 m，行免疫荧光标记者收集于 0.01 mol/L KPBS 中，余置于 60%(体积分数)甘油冻存液中-20 保存备用。1.4.5 免疫荧光双标记法标记 BrdU 与 SS取切片入 50%(体积分数)甲酰胺/2SSC 中 65 2 h，2SSC 漂洗后，入 2 mol/L HCl 中 37 30 min，0.01 mol/L(pH 8.5)硼酸液中和 10 min，浸入含 0.3%(体积分数)Triton X
12、-100 的 0.01 mol/L KPBS 30 min 后，采用鸡尾酒法进行双标记染色。首先入小鼠抗 BrdU 抗体(1200)和兔抗 SS 抗体(1500)，4 孵育 48 h 后，0.01 mol/L KPBS 漂洗，然后入 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG(1200)和 Cy3 标记的驴抗兔 IgG(1300)，避光孵育 2 h，漂洗后常规贴片、缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜观察。1.4.6 细胞计数与统计学分析每只大鼠取 6 张非连续的背侧海马一侧脑片进行观察，实验组及对照组大鼠5根据解剖学定位标志取相近部位的脑片。为了定量观察，所取脑片之间至少间隔150 m。200 倍光镜下观
13、察大鼠海马齿状回的 BrdU 阳性细胞数并计数 BrdU 阳性细胞中 SS 的阳性细胞数。细胞计数采取手工方法，由不知道实验设计的有经验的实验师进行。计数结果以均数标准差表示。采用 SPSS10.0 统计软件进行最小显著差值(LSD)法 t 检验，P0.05 时判定差异有统计学意义。 2 结果2.1 免疫双标记情况激光共聚焦显微镜下发现，海马齿状回 BrdU 免疫阳性细胞多分布于颗粒细胞层，呈圆形或卵圆形结构；门区及皮质中也有少量的 BrdU 免疫阳性细胞。SS 免疫阳性细胞形态各异，为多形态或双极神经元，分布均匀。齿状回颗粒细胞层 BrdU免疫阳性细胞大多数表达有 SS。2.2 各组海马齿状
14、回新生神经元 SS 表达的比较海马新生神经元(BrdU 免疫阳性细胞)有 SS 的表达，且电针后的癫痫大鼠其表达比未电针的癫痫大鼠减少，二者相比有统计学差异(P0.05)；癫痫组与对照组比较亦有统计学意义(P0.05)；对照组与对照+电针组大鼠海马齿状回 SS 的表达均无统计学意义(P0.05，表 1、图 1)。表 1 各组海马齿状回新生神经元 SS的表达情况（略）3 讨论癫痫作为神经科的一种常见病，其发病机制一直是国内外研究者关注的焦点，神经肽在其中起着不可忽视的作用。目前许多研究发现，在各种实验性癫痫动物模型和癫痫患者的脑组织中，SS 的含量有异常变化，提示 SS 与癫痫发作密切相关。6但
15、 SS 在癫痫中的作用是致痫还是抑痫尚未完全明确。既往的研究表明，正常大鼠中短暂的癫痫发作、点燃，甚至是单次发作均可导致新生神经元增加，增加的新生神经元是机体对癫痫发作的反应，而并非细胞损伤的结果。此种新生神经元具有何种功能目前尚不清楚。因此，本实验采用匹罗卡品诱导的 SE 后慢性癫痫模型，通过激光共聚焦观察了海马新生神经元 SS 的表达情况及电针对其表达的影响，从而明晰 SS 在癫痫中的作用。细胞增殖周期包括 G1、S、G2 和 M 4 个时期，S 期是 DNA 合成期，细胞内 DNA进行半保留复制，各种构成 DNA 的原料掺入到 DNA 中。BrdU 作为一种嘧啶类似物，其化学结构特点是胸
16、腺嘧啶环与 5 位 C 原子连接的甲基被 Br 取代，当细胞处于 DNA 合成期而同时有 BrdU 存在时就会有 BrdU 掺入到新合成的 DNA 中，只要细胞不消亡，这种 BrdU 在胞核的 DNA 中存留将是永久的。抗 BrdU 抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，经免疫组化可观察到 BrdU 在细胞内的掺入情况，故BrdU 是反映细胞增殖的理想指标8。NeuN 为成熟神经元标记物9，NeuN 共标记结果显示 90%以上新生细胞是神经元10，故本实验省去了 BrdU 与 NeuN双标记步骤。据中医经络理论，癫痫是由督脉经气阻滞，头中逆乱所致。历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说。现代研究也证实，督脉位居身体的中轴线上，可以通过双侧神经司控的特性，促进脑功能的代偿和重组作用。大椎、百会为督脉之要穴，二者相配，共奏疏通气血、醒脑开窍、回阳救逆、平衡阴阳之效。根据上述理论，本实验选取督脉经百会、大椎二穴进行研究。7本实验通过免疫双标和激光共聚焦显微镜发现，海马齿状回颗粒细胞层 BrdU免疫阳性细胞大多
