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1、1湖南大围子猪 SLADR 基因克隆及其生 物信息学分析作者：王燕, 邢晓为, 薛立群, 黄生强, 吴晓丽, 王维【摘要】 目的: 研究湖南大围子猪 SLA DR 基因特性, 评价该猪种在异种器官移植中是否具有应用前景。方法: 应用 RT PCR 扩增大围子猪 SLA DRA 和SLA DRB 基因, 插入 pUCM T 载体, 双向测序, 用 NCBI 中的 BLAST 和ExPASY 软件进行生物信息学分析。结果: 大围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 基因扩增片段大小分别为 1 177 bp 和 909 bp, 均包含完整的开放阅读框, 分别编码252 和 266 个氨基酸残基。
2、生物信息学分析结果表明, 大围子猪 SLA DRA 和SLA DRB 与人类相应的 DRA、 DRB 相比, 氨基酸同源性分别为 82%和73%。SLA DR 链与人 CD4 分子结合部位介于第 124 至 136 位氨基酸, 大围子猪 SLA DRA 在该结合区域与人类相应的 DRA 存在两个氨基酸差异, 即: 第127 位(lleVal), 第 136 位(SerThr); SLA DR 链与人 CD4 分子结合部位位于第 134 至 148 位氨基酸, 大围子猪 SLA DRB 在该结合区域与人类相应的 DRB相比氨基酸序列完全相同。与国际 GenBank 已登录的许多猪种相比, SLA
3、 DRA基因同源性高达 100%, 而 SLA DRB 基因在各猪种之间具有很高的多态性。结论: 克隆湖南大围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 基因, 该基因与人类相应的HLA DRA 和 HLA DRB 基因高度同源, 提示该猪种有望作为异种移植的候选供体。 【关键词】 SLA DR 基因; 湖南大围子猪; 基因克隆; 异种移植Abstract AIM: To evaluate the potential of Daweizi pigs as xenotransplantation 2dnors from pigs to humans by analyzing the charact
4、eristics of SLA DR genes in Hunan Daweizi pigs. METHODS: SLA DRA and SLA DRB genes were amplified by RT PCR, cloned into pUCm T vectors, sequenced and analyzed through BLAST in NCBI and related software in ExPASY. RESULTS: The SLA DRA and SLA DRB genes were 1 177 bp and 909 bp nucleotides in length,
5、 which contain opening reading frame (ORF) and encode 252 and 266 amino acids respectively. Comparing the SLA DRA and SLA DRB genes with their counterpart sequences of human, the homologies of amino acid sequences were 82% and 73% respectively. The amino acids in SLA DR chain of Daweizi pigs from po
6、sition 124 to 136, which bind to human CD4, showed only two differences with HLA DRA: a lleVal change at position 127 and a SerThr change at position 136. The amino acids in SLA DR chain of Daweizi pigs from position 134 to 148, which bind to human CD4, were identical with HLA DRB. Further compariso
7、n with SLA sequences published in GenBank indicated that SLA DRB gene found in Daweizi pigs has polymorphism while the homology of SLA DRA gene is up to 100%. CONCLUSION: The cloned SLA DRA and SLA DRB in Hunan Daweizi pigs has high polymorphism with HLA DRA and HLA DRB in Human, indicates that Dawe
8、izi pigs have some advantages as xenotransplantation dnors from pigs to humans.KeywordsSwine leukocyte antigen DR allele (SLA DR); Daweizi pigs; gene cloning; xenotransplantation同种异体器官移植已成为治疗终末期器官衰竭的一种有效手段, 猪被认为是异种移植最理想的供体来源1。然而, 如何解决免疫排斥问题仍是阻碍临床大规模应用的主要问题之一2。猪的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility com
9、plex, MHC), 又称作猪白细胞抗原(swine leukocte antigen, SLA), 是由紧密连锁的高度多态基因座所组成的染色体的一个遗传区域, 它作为主要组织抗原, 参与移植排斥反应, 是引起异种移植急性细胞性排斥的主要遗传因素3。通过对供体猪种进行筛查, 尽可能选择与人类 MHC 同源性较高的猪种将有助于提高异种移植物在人体内的存活时间, 为临床大规模开展将猪器官或细胞异种移植到人提供理想的供体猪种来源。中国具有丰富的猪种种质资源, 不同的地域分布形成了猪种的多样性和遗传的相对稳定性, 为异种移植提供了可贵的研究和利用资源4。湖南大围子猪是我3国特有的地方猪种之一, 亦是
10、湖南省著名地方优良猪种, 具有繁殖力强、 抗逆性强、 耐粗饲、 肉质好、 生长慢、 饲料效率高等种质性状。但是, 大围子猪能否作为异种移植的供体, 尤其是该猪种细胞表面 SLA 特性如何, 目前尚不清楚。本研究将克隆湖南大围子猪 SLA DR 基因, 分析其 SLA DRA 和 SLA DRB 基因特性, 比较与人 CD4 分子结合部位大围子猪 SLA DR 编码氨基酸与人类相应DRA、 DRB 的同源性, 为评价湖南大围子猪在异种移植中的应用前景, 提供免疫学方面的依据。1 材料和方法1.1 材料 总 RNA 抽提试剂盒购自美国 Gentra 公司; cDNA 第一链合成试剂盒购自 Ferm
11、entas 公司; pUCM T 载体、 引物、 电泳试剂等购自上海生工生物工程技术服务有限公司; PCR 高保真克隆酶 Easy A 购自 Stratagene 公司; DNA marker(100 bp ladder)购自晶美生物工程公司; 湖南大围子猪来自湖南望城大围子猪保种基地。1.2 方法1.2.1 湖南大围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 基因引物设计 根据 GenBank数据库中已登录的明尼苏达小型猪(Minnesota miniature swine)的 SLA DR 序列(登录号为 M93028, AB205163), 采用 PCRDESN 软件设计以下引物。SLA
12、DRA: 上游引物 : 5 GGC ATC TAA GGA GAA AAT GAC 3; 下游引物: 5 CCA CTC AAA GTT TAT TGT ATT CAG 3, 预计扩增片段大小为 1 177 bp; SLA DRB: 上游引物: 5 TTG TCC TCT CCT GTT CTC CAG 3; 下游引物: 5 TAG GAC GCA GAG CAT AGC AGG 3, 预计扩增片段大小为 909 bp。1.2.2 RT PCR 扩增湖南大围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 基因 在湖南大围子猪保种群中随机挑选两头个体, 以 700 mL/L 乙醇消毒耳尖取耳样组织,
13、按4RNA 抽提试剂盒(Gentra 公司)说明书方法提取总 RNA。测定每一样品总 RNA 的浓度, 模板定量为 1 g RNA, 按 RevertAidTM First strand cDNA Synthesis kit 说明书方法逆转录合成 cDNA 第一链。以合成的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增, 20 L PCR 反应体系中, 分别加入下列物质: DEPC 处理水 13.5 L, PCR 缓冲液 2 L, 25 mmol/L MgCl2 1.6 L, 10 mmol/L dNTP 混合物 0.5 L, 50 mmol/L 上、 下游引物各 0.2 L, 模板 1.6 L, Ea
14、sy A 高保真酶 0.4 L。在 PE9700 型 PCR 扩增仪上完成 PCR 扩增, 扩增条件如下: 先 95预变性 2 min 30 s, 94变性 40 s, 5859退火 40 s, 72延伸 40 s, 完成 35 个循环, 最后 72延伸 5 min, 置 4保温。取 3.5 L PCR 扩增产物, 1.5 g/L 琼脂糖凝胶电泳, 以鉴定 PCR 扩增结果。1.2.3 湖南大围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 基因克隆与鉴定 连接反应在10 L 体系中进行: 双蒸水 3 L、 PCR 产物 1 L、 pUCm T 载体 1 L 混匀后加入 5 L Solution,
15、16水浴连接过夜, 转化感受态大肠杆菌 JM109(采用 CaCl2法制备), 4静置 30 min 后放入 42水浴中热休克 90 s, 加入 300 L 预热的 LB培养基, 37下振荡培养(200 r/min) 45 min, 将菌液平铺于含氨苄青霉素的固体培养基上, 37恒温箱中培养过夜。挑取单克隆, 在含氨苄青霉素 200 mg/L 的液体LB 培养基中培养, 以菌液为模板, PCR 鉴定为阳性克隆, 抽提质粒, 送上海英骏生物技术有限公司双向测序。1.2.4 湖南大围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 基因生物信息学分析 用 NCBI Homepage 中的 ORF 对湖南大
16、围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 基因的开放阅读框进行识别; 用 ExPASY 服务器中的 PROSITE SCAN 软件对 SLA DRA 和SLA DRB 基因的功能域进行预测; 用 NCBI 中的 BLAST 及 ExPASY 服务器中5的 CLUSTALW 等软件对获得的 SLA DRA 和 SLA DRB 基因的序列结构进行比较分析。2 结果2.1 湖南大围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 基因 RT PCR 扩增结果 RT PCR 扩增结果显示, 两头湖南大围子猪 SLA DRA 和 SLA DRB 均有特异性扩增条带, 大小分别为 1 177 bp 和 909 bp, 与预期扩增片段大小一致(图 1)。2.2 湖南大围子猪 SLA DRA 基因测序结果 测序大围子猪 SLA DRA 基因, 结果表明: 来源于两个不同个体的 SLA DRA 基因序列是一致的, 其 cDNA 全长均为 1 177
