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1、1神经组织工程修复脊髓损伤中的种子细 胞作者：曾晗冰，李士， 李万里，徐华梓【摘要】 脊髓损伤后局部产生的各种抑制因子以及神经断端之间的瘢痕都是脊髓损伤难以修复的重要原因。通过细胞移植不仅可以补充局部损失的细胞，而且可以促进损伤脊髓功能的恢复。本文对脊髓损伤修复中的各种常见种子细胞进行了综述，并对各种细胞的优缺点进行了讨论。最后根据目前的研究现状，对细胞移植治疗脊髓损伤的研究趋势进行了展望。 【关键词】 脊髓损伤； 组织工程； 神经组织； 种子细胞； 修复Abstract：The inhibitory environment and loss of axonal connections aft
2、er spinal cord injury pose many obstacles to regenerating the lost tissueCellular therapy provides a means of restoring the cells lost to the injury and could potentially promote functional recovery after such injuriesThis review presents a summary of the various types of cellular therapy used to tr
3、eat spinal cord injury.A wide range of cell types have been investigated for such uses and the advantages and disadvantages of each cell type are discussed along with the research studying each cell typeBased on the current research，suggestions are given for future investigation of cellular therapie
4、s for spinal cord regenerationKey words：spinal cord injury; tissue engineering; neuro tissue; seed cells; repair脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重危害人类健康的疾患，其具有高发生率、高致残率及高医疗耗费等特点，现已成为全球性的医疗难题。传统的治疗方法对于已损伤脊髓的治疗效果尚不满意1。近年来，随着神经组织工程技术的飞速发展，利用组织工程细胞移植修复神经损伤成为可能，其为脊髓损伤治疗提供了新的思路。神经组织工程即应用组织工程学原理和技术方法构建组织工程化
5、的2具有生物活性的神经替代物，其核心技术是在种子细胞和生物支架之间构建一活性微环境，从而达到促进神经修复的目的。本文就神经组织工程修复脊髓损伤中种子细胞的研究进展及应用前景作一简要综述。采用细胞移植治疗脊髓损伤的主要目的是为再生轴突提供支架，分泌各种营养因子从而促进轴突生长，替代损伤缺失的细胞和组织。其可能的机制为：(1）桥接脊髓损伤断端，形成功能性突触，重新建立神经传导通路；(2)分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达，从而促进轴突的再生；(3)使损伤的脱髓鞘轴索再髓鞘化，恢复有髓神经的电传导功能。目前研究的热点有神经干细胞、胚胎干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞及骨髓
6、间充质干细胞等，它们均被证明用于构建组织工程化神经移植细胞时，可以促进受损脊髓功能得到不同程度的恢复。1 神经干细胞(neural stem cells，NSCs)神经干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞，能分化成各种神经系统的细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，而且具有自我更新和维持的能力，并具有一定的迁移能力，能到达损伤或疾病部位并产生新细胞。NSCs 主要来源于胚胎或成年哺乳动物中枢神经系统的不同部位(包括海马齿状回颗粒下层、侧脑室及脊髓的室管膜以及皮质及杏仁核等部位)2。神经干细胞移植治疗脊髓的机制可能为：(1)补充外伤后缺失的神经元和胶质细胞，为损伤脊髓重新建立传导通路，形成功
7、能性突触，同时产生多种细胞外基质，填充脊髓损伤后遗留的空腔，为再生的轴突提供支持物;(2)NSCs 分化后产生的神经元和胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达，使损伤轴突开始再生;3(3)使残存脱髓鞘的神经纤维形成新的髓鞘，保持神经纤维功能的完整性3。Lepore 等4将从大鼠胚胎脊髓组织分离的脊髓 NSCs 植入脊髓损伤模型 15 个月后，通过人胎盘碱性磷酸酶免疫染色证实移植的神经干细胞向神经元分化，并且电镜观察发现新生神经元与宿主神经元间有新建立的突触。运动学检测表明，移植组大鼠前肢运动功能得到了明显的改善，但与正常动物仍有一定差距。Tarasen
8、ko 等5以重物打击造成大鼠 T10 脊髓损伤模型，将抗原预处理过的人胚胎来源的 NSCs 移植入损伤部位，通过组织学切片及大鼠功能恢复评价分析，发现在损伤 3 个月后，移植处的 NSCs 能正常存活，大鼠的运动功能得到了很大程度的恢复。采用基因治疗手段修复脊髓损伤是目前的热点。Wang 等6将 NT3基因逆转录至病毒构建载体，经筛选阳性细胞克隆后转染入 NSCs，通过RTPCR、Western 杂交法、免疫化学等方法证实了 NT3 合成量明显增加，证明应用 NT3 eDNA 对中枢神经系统损伤的基因治疗是可行的。上述研究结果均表明神经干细胞移植在修复脊髓损伤和改善自体运动功能方面具有肯定疗效
9、。此外，由于神经干细胞通常取材于患者自身，可以较好地解决其他类型的异体干细胞难以回避的个体排斥问题。NSCs 分离和培养的成功，尤其是采用编码致癌蛋白的外源性遗传信息使 NSCs 永生化，解决了移植物数量不足的问题，也避免了伦理学方面的问题。因此，理论上神经干细胞是移植替代治疗的首选干细胞类型。然而，动物实验发现，在受损脊髓内炎症细胞因子的作用下，NSCs 植入体内后不再分化或仅向星形胶质细胞分化从而参与瘢痕组织形成，而且脊髓的微环境仅适合NSCs 分化为胶质细胞而不利于其分化为神经元，因此如何将 NSCs 定向分化为神经元也是一个难题。另外，NSCs 取材来源有限，获取材料时手术具有侵袭性，
10、难以获得患者的认同，也限制了 NSCs 直接应用于临床。42 胚胎干细胞(embryonics tem cells，ESCs)胚胎干细胞是从哺乳动物的囊胚内细胞群（ICM)和原始生殖细胞经体外分化、抑制培养并分离克隆出来的一种原始、高度未分化细胞。ESCs 在体外培养系统中可扩增并可维持其全能性。胚胎干细胞还能广泛参与宿主胚胎各组织、器官生长发育，形成嵌合体。Hamada 等7利用 MASH1 基因导入 ESCs 后不表达 Nogo 受体的特点，将该细胞移植入大鼠脊髓损伤模型后，通过绿色荧光蛋白(GFP)标记细胞观察到 ESCs 能显著促进轴突的生长，电生理检测发现大鼠下肢的运动功能有明显改善
11、。Deshpande 等8将 ESCs 来源的运动神经元移植入下肢瘫痪大鼠的损伤脊髓处，术后发现轴索长入肌肉，形成有效的神经肌接头结合，大鼠的瘫痪也得到了一定程度的恢复。以上研究表明胚胎干细胞主要是通过发挥中继作用修复受损神经元，并使轴突形成完整的神经环路，释放促进神经元再生的营养因子，快速重建轴突的连续性。但是也有学者得出了不同的结论，Cloutier 等9把来源于人胚胎干细胞的少突胶质细胞分别移植入严重脊髓损伤并出现脱髓鞘及轻度脊髓损伤未出现脱髓鞘的成年大鼠中，通过观察移植细胞的存活、迁移，发现对于轻度损伤未出现脱髓鞘的脊髓，人胚胎干细胞并不能促进髓鞘的再生，提示人胚胎干细胞分化的少突胶质
12、细胞进行移植治疗的先决条件是出现脊髓脱髓鞘。目前，胚胎干细胞的临床应用存在颇多障碍，由于采用胚胎干细胞进行临床治疗时必须取材于人类胚胎，有限的来源和取材过程中难以回避的伦理学和法律学问题成为其广泛应用过程中的瓶颈10。此外，未分化的胚胎干细胞具有潜在的致瘤效应，且植入成熟中枢神经系统的非神经区后保持不分化或主要向神经胶质细胞分化也是胚胎干细胞移植的一大难题。53 嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)嗅鞘细胞是一种能够终生有助于嗅神经元轴突生长和再生作用的胶质细胞，它起源于嗅球基底膜，分布在嗅球和嗅神经的最外层11。嗅鞘细胞作为脊髓组织工程的种子细胞具有两
13、个明显的优势：(1)既能像雪旺细胞一样存在于外周神经有助于轴突的生长，又能像星形胶质细胞一样存活于中枢神经系统；(2)嗅黏膜和嗅神经具有终生再生的能力，研究发现正是由于嗅鞘细胞的存在，才使得其具有不断再生的能力。自从 Li12等在 1997 年首次应用嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤取得满意效果后，嗅鞘细胞现已被广泛应用于各种急性脊髓损伤的动物模型，如脊髓全切、半切、脊髓束损伤等。尹国栋等13将人胚胎嗅鞘细胞移植入 T10 脊髓横断损伤的大鼠体内，采用免疫细胞化学染色、荧光显微镜、大鼠功能 BBB 评分等指标观察损伤大鼠的恢复情况，结果在术后 10 周时仍可观察到嗅鞘细胞存活，荧光示踪提示实验组功能神
14、经纤维、神经突触数目和密度均高于对照组，BBB 评分在术后 6 周时显著提高。嗅鞘细胞不但可以促进急性脊髓损伤的修复，而且对于迟发型的脊髓损伤同样有较好的修复作用。Raisman14及其团队将嗅鞘细胞悬液单独植入 C1 单侧皮质脊髓束损伤 8 周后的动物模型中，结果实验组动物在13 周后功能得到了明显的恢复，他们认为嗅鞘细胞诱导髓鞘生成是脊髓修复的重要原因。此外，嗅鞘细胞也可以分泌多种神经营养因子，如神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素3(NT3)等，以保护神经元的生存和提供神经轴突生长及髓鞘化所需的细胞外基质15。除了拥有良好
15、的脊髓修复能力，嗅鞘细胞还具有取材方便、易于体外纯化和扩增的优点，使其容易在临床推广。Feron16及 MackaySim17等将自体6嗅黏膜鞘细胞移植于慢性脊髓损伤患者的期临床实验正在进行中，1、3 年的随访结果显示：采取人自体嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的方法是安全、可行的，但临床疗效并没有如脊髓损伤动物模型那样显著，6 位完全脊髓损伤(ASIA 分级 A 级)的病人中只有 1 位病人的感觉功能得到了轻度的恢复，其余病人与术前相比无明显改善。目前，嗅鞘细胞在脊髓损伤中的作用机制、移植细胞的最佳数量和移植方式，以及移植后发挥有效作用的持续时间等，都是尚待解决的问题。 4 雪旺细胞(schwann c
16、ells，SCs)雪旺细胞又称神经膜细胞，属于周围神经系统的胶质细胞，它可以在脊髓损伤后自主迁移至受损部位。研究发现雪旺细胞可能通过以下几种机制促进轴突再生而达到修复脊髓的作用：(1)分泌神经黏附分子(NCAM)等细胞黏附分子以及胶原、层粘连蛋白等细胞外基质分子，这些蛋白都有不同程度的支持和促进神经元轴突生长的能力18；(2)产生各种神经营养因子(NTFs)，包括成纤维生长因子2(FGF2)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)和神经营养素3(NT3)等来促进髓鞘形成19。Oudega 等20将培养后的雪旺细胞移植入脊髓损伤模型中发现雪旺细胞能够促进轴突再生及髓鞘形成，但是由于损伤周围胶质疤痕的抑制作用无法使再生轴突进一步越过移植物与宿主的界面，因此不能与脊髓神经元形成新的突触，相关的功能也不能恢复。Girard 等21将表达 BDNF 或 NT3 的载体(vector)转染雪旺细胞后，将转基因细胞移植到裸鼠脊髓脱髓鞘部位，行为学分析
