《去细胞肌肉组织工程支架与人羊膜上皮细胞的相容性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《去细胞肌肉组织工程支架与人羊膜上皮细胞的相容性研究（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1去细胞肌肉组织工程支架与人羊膜上皮 细胞的相容性研究作者：薛辉 陈东 刘佳梅 刘颖 孟晓婷 殷迪【摘要】 目的 制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用三硝基甲苯和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养 7 d 后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT 3 及 BDNF 的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现 NT 3、BDNF 免疫反应阳
2、性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。 【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性【Abstract】 Objective To produce the acellular muscle as biomaterial scaffold and to observe its biocompatibility with the human amniotic epithelial cell. Methods The acellular muscle scaffolds were made by e
3、xtraction with 3% Triton X 100 and 1% sodium dodecyl sulfate. The histological structure of acellular muscle was observed in frozen section. Then the cultured human amniotic cells were implanted into acellular muscle scaffolds. After cultured 1 w, the scaffolds with cells were sectioned, and BrdU，NT
4、 3 and BDNF immunohistochemical staining were performed to observe the proliferating capacity and the expressions of NT 3 and BDNF of amniotic cells in scaffold. SEM was performed to examine the distribution of human amniotic epithelial cells growing in scaffold. Results The cells in scaffold comple
5、tely disappeared after the muscle had been extracted. The scaffold of acellular muscle was arranged in parallel tubules composed of collagen fibers and elastic fibers which were left intact. In scaffold the human amnion cells could proliferate and synthesize NT 3 and BDNF. 2Scanning electron microsc
6、opy demonstrated a uniform distribution of cells in scaffold. Conclusions The cells in rat skeletal muscle are successfully removed by chemical extraction. The acellular muscle scaffold made in this way possess good compatibility with human amniotic cells.【Key words】 Acellular muscle; Human amniotic
7、 cell; Biocompatibility近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche 等1把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w 后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞2，3。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子4，5，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方
8、法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。1.1.2 试剂 IMDM 培养基及小牛血清由 Hyclone 公司提供。5 溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及 BrdU 单克隆抗体购自 Neomarker 公司;神经营养素(NT) 3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC 免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。31.2 方法1.2.1 去细胞肌肉支
9、架的制备 参考 Brown 等6去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取 Wistar 大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37、50 r/min 摇 48 h 后,转入 3%的 TritonX 100 溶液,摇床中 37、50 r/min 摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床 37、50 r/min 摇 48 h。换成 1% SDS 溶液，摇床37，50 r/min 摇 48 h。PBS 洗 24 h。PBS 中 4保存备用。1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用 4%多聚甲醛 PBS 固定 1 h，5%蔗糖 90 min，15%蔗糖 90
10、 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT 包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行 Van Gienson(VG)染色和 Weigert 染色(VG+ET 染色)检测支架的细胞外基质成分。1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在 DMEM 培养液中(含 10%胎牛血清，100 U/ml 青霉素，100 mg/ml 链霉素，200 g/ml 的谷氨酰胺)，37、5 % CO2 及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定1.
11、2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心 3 min。用 DMEM 重悬细胞。用 1 ml 注射器吸入细胞悬液，以 2106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至 24 孔4板中，在 37、5 % CO2 及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养 1 w。掺入 Brdu(终浓度为 10 mg/L)，继续培养 1 d 后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经 PBS 洗后，3% H2O2 灭活内源性过氧化物酶 10
12、min，血清封闭 20 min;一抗用 BrdU(11 000 稀释)单克隆抗体，BDNF 和 NT 3 多克隆抗体(1100 稀释)4孵育过夜，PBS 洗后，二抗 37孵育 30 min，PBS 洗后，SABC37孵育 30 min，DAB 显色。光镜下观察。1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在 24 孔板中，在 37、5 % CO2 及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养 7 d 后，用 2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2 临界点干燥，镀
13、膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。 2 结 果2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的 HE 染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET 染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图 1。2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图 2，HE 染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图图 1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色图 2 去细胞肌肉支架的病理图片 2A)。免疫组
14、化染色显示，BrdU 阳性细胞数5目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图 2B)。抗 NT 3 和 BDNF 染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有 NT 3、BDNF 阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图 2C，2D)。JSM 5600LV 扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图 2E)。3 讨 论理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性7，8。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细
15、胞肌肉支架上9。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管10，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间9，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa 等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的11。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小9，12。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用
16、的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET 染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。6由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限13，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括胰岛素样生长因子、层黏蛋白、转移生长因子、前列腺素 E、表皮生长因子样物质,IL 1，IL 8 等因子，另外，还可分泌 BDNF 和 NT 3 等重要的神经营养因子4。其中层黏蛋白、BDNF 和 NT 3 等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞
