《加味小柴胡汤对顺铂诱导BRL细胞核转录因子和热休克蛋白70表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《加味小柴胡汤对顺铂诱导BRL细胞核转录因子和热休克蛋白70表达的影响（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1加味小柴胡汤对顺铂诱导 BRL 细胞核转 录因子和热休克蛋白 70 表达的影响作者：刘应柯,张玉峰,宫璀璀,刘尚岭【摘要】 目的 观察加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝 BRL 细胞核转录因子-kB(NF-kB)、热休克蛋白 70(HSP70)表达的影响。方法 将 BRL 细胞分为 4 组：空白组、顺铂组及加味小柴胡汤大、小剂量组。采用完整细胞蛋白质斑点印迹、免疫组织化学等方法,检测各组细胞 NF-kB、HSP70 变化。结果 顺铂组 NF-kB 表达明显较空白组升高,HSP70 表达降低,组间比较差异有统计学意义；加味小柴胡汤大、小剂量组 NF-kB 明显较顺铂组低,差异有统计学意义；加味小柴
2、胡汤大、小剂量组 HSP70 表达均升高,但仅加味小柴胡汤大剂量组差异明显。结论 加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的 BRL 细胞 NF-kB 表达,上调 HSP70 表达,此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡重要机理之一。 【关键词】 BRL 细胞；顺铂；加味小柴胡汤；细胞核转录因子-kB；热休克蛋白 70Abstract：Objective To study the effect of modified Xiaochaihu Decoction on NF-kB and HSP70 of BRL cell induced by cisplatin. Methods BRL Cells
3、were divided into control group, cisplatin group, high and low dose of modified Xiaochaihu decoction. Complete cell protein dot blot technique and immunohistochemisth analysis were appllied to detect the change of NF-kB and HSP70. Results There was a significant increase in NF-kB and decrease in HSP
4、70 of BRL cell induced by cisplatin compared with control group. There was a significant decrease of NF-kB in modified Xiaochaihu decoction group compared with cisplatin group. There were increases of the expression of HSP70 in both high and low dose group, but only the high dose group demonstrated
5、significant difference. Conclution The expression of NF-kB of BRL cell induced by cisplatin can be inhibited while the expression of HSP70 can be enhenced by modified Xiaochaihu decoction. It may be one of important mechanisms of relieving cell oxidize lesion and inhibiting apoptosis by modified Xia
6、ochaihu decoction.2Key words：BRL cell；cisplatin；modified Xiaochaihu decoction；NF-kB；HSP70核转录因子-kB(NF-kB)是一种能与免疫球蛋白 k 轻链基因的增强子 kB 序列特异结合的蛋白因子,具有多向转录调节作用,当细胞氧化损伤后 NF-kB 的表达增强1。热休克蛋白(HSP)是机体在各种应激性侵害时所产生的一种高度保守蛋白质, HSP70 是 HSP 中最重要的一种中等分子量蛋白,其表达能够对应激状态下细胞产生保护作用。HSP 的细胞保护作用可能是恢复和维持抗氧化酶功能,修复其在应激状态时被破坏的功能蛋
7、白,从而稳定细胞结构,使细胞维持正常的生理功能2。笔者利用体外细胞培养方法,观察了顺铂诱导 BRL 细胞应激反应损伤时 NF-kB、HSP70 的异常表达及加味小柴胡汤的调控作用。1 实验材料正常大鼠肝 BRL 细胞,广州中山大学动物实验中心细胞库提供。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM、单克隆抗体、TUNEL 检测试剂盒均购自 Sigma 公司。顺铂为齐鲁制药有限公司生产,批号 0503007。加味小柴胡汤由中国人民解放军第 153 中心医院中药制剂室制备(原药材 1 g/mL)。2 实验方法2.1 细胞分组及处理取处于对数生长的 BRL 细胞随机分为 4 组(每组 6 瓶)。空白组：加入含有 1
8、0%胎牛血清的 DMEM 培养基；顺铂组：加入顺铂 5 mg/L 及 10%胎牛血清的 DMEM培养基；加味小柴胡汤大剂量组：加入顺铂 5 mg/L、10%胎牛血清的 DMEM 培养基及加味小柴胡汤 4 mg/mL；加味小柴胡汤小剂量组：加入顺铂 5 mg/L、10%胎牛3血清的 DMEM 培养基及加味小柴胡汤 2 mg/mL。在 37 、0.5% CO2 培养箱中培养 48 h 后,将胰蛋白酶消化的细胞制备成细胞混悬液。将收获的 4 组细胞分别制成细胞滴片(1107/mL 细胞混悬液滴加至预先处理过的硝酸纤维素膜和载玻片上)、细胞裂解液,并提取 DNA 和蛋白质,进行免疫组化检测。2.2 完
9、整细胞蛋白质斑点印迹采用间接酶标抗体免疫组化法：点膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的蛋白质,加 0.5%吐温-20/TBS(Tris- HCl pH 7.2)封闭,加各自的一抗,0.01%吐温-20/TBS 洗 2 次,加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔 IgG,加 DAB/NBT-BCIP 底物液进行免疫组化显色,以 PBS 代替一抗作为阴性对照。2.3 免疫细胞化学染色4%多聚甲醛固定后的细胞标本入 0.3%Triton X-100/PBS 透化后,加 10%正常羊血清,甩去多余血清,加 1100 稀释的各种一抗,置 4 湿盒内孵育过夜。PBS,pH 7.5 洗后,加 1200 稀释的
10、二抗(鼠 IgG-HRP),置 37 湿盒内孵育 1.5 h,以 DAB 显色。阴性对照实验用 PBS 代替一抗。2.4 检测指标对细胞蛋白质斑点的印迹应用薄层层析扫描仪(Shimadu,日本)进行扫描并对免疫组织化学标本染色,应用图像分析仪(山富,中国)扫描各标本的免疫反应信号的灰度值。 3 统计学方法采用 SPSS11.5 软件对以上数据进行统计学分析。所有数据用 xs 表示,均值之间4比较采用 t 检验。4 结果4.1 加味小柴胡汤对顺铂诱导 BRL 细胞核转录因子-kB、热休克蛋白 70 表达的影响(见表 1) 表 1 各组细胞 NF-kB、HSP70 蛋白表达扫描灰度值(略)注：与空
11、白组比较,*P0.01；与顺铂组比较,P0.05,P0.014.2 各组细胞免疫组化显色比较细胞 NF-kB 经 DAB 染色呈棕黄色,正常组染色浅淡,顺铂组呈棕褐色,加味小柴胡汤大、小剂量组均明显较顺铂组浅淡,加味小柴胡汤大剂量组更为显著。提示顺铂处理组细胞 NF-kB 表达较正常组明显,应用加味小柴胡汤的实验组可下调 NF-kB 表达(见图 1)。细胞 HSP70 染色呈棕色,正常组细胞染色较深,顺铂组较浅,加味小柴胡汤大、小剂量组染色均明显较顺铂组深。提示正常细胞 HSP70 表达明显,顺铂组 HSP70 表达降低,加味小柴胡汤大、小剂量组细胞 HSP70 表达明显上调(见图 2)。5
12、讨论NF-kB 是由 B 淋巴细胞核提取物中检测到的一种能与免疫球蛋白 k 轻链基因的增强子 kB 序列特异结合的蛋白因子,典型的 NF-kB 由 p53 和 p65 亚基组成。在静止状态下,NF-kB 与 I-kB 抑制性蛋白结合处于未活化状态。当细胞受到炎性细胞因子、LPS 等刺激时,I-kB 激酶活化,I-kB 从 NF-kB 复合体上解离,NF-kB 发生核易位并与特定的 DNA kB 序列结合而促进基因转录。NF-kB 可被炎性细胞因子激5活,而后又诱导炎性细胞因子的表达。因此,早期应用抑制 NF-kB 活化药物,对控制炎症介质的大量释放将有所裨益3。由于活性氧(ROS)可激活 NF
13、-kB 的表达4,在 H2O2 诱导的细胞凋亡中,可见 NF-kB 激活转录因子 p53 的表达5。本实验结果表明,顺铂诱导的 BRL 细胞 NF-kB 表达明显升高,提示顺铂致肝细胞损伤的发生机制与 NF-kB 的高表达有关。HSP 蛋白作为分子伴侣作用,是生物体或离体培养细胞在不良环境因素作用下所产生的一组具有高度保守性的应激蛋白,能保护细胞不受或少受损害。HSP70 是目前发现的主要分子伴侣之一,能与蛋白分子结合,保护新合成的恰当构型。当蛋白质受损变性时,能促使其恢复或加速其降解和消除,以维护细胞的功能和生存。HSP70 的增加可以提高细胞在各种应激状态下的生存能力,其细胞保护作用与应激
14、时受损蛋白质的修复或移除有关,主要有抗氧化作用、协同免疫作用、抗细胞凋亡作用等几方面6。HSP70 可增强机体对多种应激原的耐受能力,由于各种有害应激可激活细胞内应激激酶而导致细胞凋亡,而 HSP70 基因表达水平的增加,可抑制应激激酶的激活,防止细胞凋亡,这无疑对预防肝细胞损伤有积极意义。本研究提示,加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的 BRL 细胞 NF-kB 表达,上调HSP70 表达,此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡的重要机理之一。【参考文献】1 Lee YJ, Kang IJ, Bunger R, et al. Enhanced survival effect of pyruv
15、ate correlates MAPK and NF-kB activition in hydrogen peroxide- treated human endothelial cellsJ. J Appl Physiol,2004,96：793801.2 范云霞,黄常志.热休克蛋白 70 与肿瘤J.国外医学?肿瘤学分册, 2000,27(4)：196.63 Tokuyasu H, Tomita K, Hitsida Y. An inhitory effect of dexamethesone on A549 cell adhesion to neutrophils：possible invo
16、lvement of nuclear factor-kappa BJ. Yonago ActaMed,1999, 42：1120.4 Zafarullah M, Li WQ, Sylvester J, et al. Molecular mechanisms of N- acetylcysteine actionsJ. Cell Mol Life Sci,2003,60：620.5 Datta K, Babbar P, Srivastava T, et al. p53 dependent apoptosis in glioma cell lines in response to hydrogen peroxide induced oxidative stressJ. Int J Biochem Cell Biol,2002,34：14481457.6 张旭辉,裴国献,魏宽海.高温高湿环境犬肢体火器伤后 HSP70 含量变化的实验研究J.第一军医
