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1、1同型半胱氨酸对 ECV304 细胞 NFB 活性的影响及金雀异黄酮的保护机制【摘要】 目的 检测同型半胱氨酸(HCY)对人脐静脉内皮细胞株 ECV 304 的损伤对细胞核因子(NF B)活化的影响及金雀异黄酮（GEN)的保护作用。方法 以5.0 mmol/ L 的 HCY 作用于 ECV 304 细胞：设不同浓度的 GEN（10、50、100 mol/L）保护组孵育 12 h 后，再加入 5.0 mmol/L 的 HCY，通过四噻氮唑盐（MTT）比色法观察细胞活性，通过 Western 印迹法、免疫组化观察 NF B 表达情况。结果 HCY 可降低 ECV 304 细胞的细胞活力，NF B
2、表达增强；而在加入不同浓度的 GEN 预处理后，细胞活性显著增高，NF B 表达水平显著下降，且呈现剂量依赖性（r=-0.95，P0.05）。结论 HCY 可作用于 ECV 304 细胞，活力下降，上调 NF B 蛋白及其靶基因的表达，而 GEN 能逆转 HCY 所引起的 NF B 活性增高的作用。 【关键词】 金雀异黄酮（GEN）； 同型半胱氨酸（HCY）；人脐静脉内皮细胞；NF B【Abstract】 Objective To study the effect of homocysteine (HCY) on activation of NF B in ECV 304 and explor
3、e the protection of Genistein (GEN). Methods MTT assay was used to detect cell viability, and the expression of NF B was observed by Western blot and immunohistochemistry. Results The cellular viability of 5.0 mmol/ L HCY (41.275.09)% was lower than those of the other groups, and the expression of N
4、F B increased too. After co treatment of 5.0 mmol/L HCY and different concentration GEN（10, 50, 100 mol/L）, the cellular viability of each group had elevated and the expression of NF B decreased. Conclusions HCY can lead to endothelial dysfunction in ECV 304 by increasing the activity of NF B. GEN c
5、an protect the cell viability and decrease the expression of NF B.【Key words】 Genistein；Homocysteine；ECV 304 cells；NF B动脉粥样硬化(AS）是一类严重危害人类健康的心血管疾病，其发生发展与多2种因素有关。同型半胱氨酸(HCY)属含硫氨基酸，体内不能合成，能够引起内皮细胞功能紊乱1。大量实验证明，HCY 是导致 AS 的独立的危险因素。金雀异黄酮(GEN)，可以改善血管内皮功能2,可以抑制 HCY 诱导的炎症损伤,抑制内皮细胞与白细胞/血小板等黏附3,具有防止早期 AS 等多种药
6、理作用及生物活性。本研究通过观察 HCY 对 ECV 304 血管内皮细胞刺激的细胞核因子 NF B 的影响，同时观察 GEN 的保护作用，旨在探讨 HCY 致 AS 的机制以及 GEN 的保护作用，为其应用于临床治疗 AS 提供科学的理论依据。1 材料与方法1.1 主要试剂人脐静脉内皮细胞株 ECV 304（武汉大学中国生物典藏中心）；HCY、GEN、DMSO 均购于 Sigma 公司；四甲基噻唑氮蓝(MTT) 购于 Fluka 公司；鼠抗人 NF B p65 抗体、羊抗鼠 IgG、 actin 抗体购于 Santa Cruz 公司。1.2 方法1.2.1 ECV 304 细胞培养人脐静脉内
7、皮细胞株 ECV 304 细胞接种于含 10%灭活小牛血清的新鲜RPMI 1640 培养液中，置 37、5% CO2 培养箱中。所有实验操作均采用对数生长期的细胞。1.2.2 实验处理HCY 用无血清 1640 培养液混匀，GEN 用 DMSO 溶解，实验分为 5 组，正常3对照组；HCY 5.0 mmol/L 组；GEN 10 mol/L+ HCY 5.0 mmol/L 组；GEN 50 mol/L+ HCY 5.0 mmol/L 组；GEN 100 mol/L+ HCY 5.0 mmol/L 组。对照组加不含任何药物的培养液 100 l ，每组设 4 个复孔。1.2.3 MTT 法检测细胞
8、生长情况参照 Tada 测定细胞活性的改良法4，消化细胞调整浓度至 4104 ml-1，接种于 96 孔培养板，每孔 100 l，培养过夜，细胞贴壁生长，80融合时，吸弃原培养液。实验组预先加入终浓度为 0、10、50、100 mol/L 的 GEN 孵育 12 h，再分别加入终浓度为 5.0 mmol/L HCY 的 RPMI 1640 培养液 100 l，对照组加不含任何药物的培养液 100 l，每组设 4 个复孔；同时设空白对照（只有培养液，无细胞）。继续培养 48 h。上述每孔分别加入 20 l MTT (5 mg/ ml)，置 5%CO2 37 孵育 4 h后，加三联溶解液每孔 10
9、0 l (10% SDS+5%异丁醇+0.012 mol/L 的 HCl)，二氧化碳培养箱中继续培养 14 h，镜下观察甲臜结晶全部溶解后，以空白孔调零，酶标仪检测 570 nm 处的吸光度值(A570)。细胞活力(%) = 实验孔 A570 值/对照孔 A570值100%。1.2.4 SDS PAGE 电泳及 Western 印迹法测 NF B p65 蛋白表达水平取培养细胞(51061107)个/ml，4离心，500 r/min，3 min 收集细胞，提取的胞浆蛋白和核蛋白用考马斯亮兰法（Braford 法）进行蛋白定量。12聚丙烯酰胺凝胶电泳（V=70 V/40 min、120 V/2
10、h），转膜（I=180 mA）4 h 至 PVDF 膜上，5脱脂奶粉封闭，鼠抗 NF B p65 37孵育 1 h，PBST 洗 4 次，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG 室温下摇荡孵育 1 h，PBST 洗 4 次，ECL 液显色，自动凝胶成4像系统处理，测量条带光密度值（OD 值），以 actin 为内参照，求得比值，进行半定量分析，试验重复 3 次。1.2.5 免疫组化染色（ABC 法）细胞接种于置有盖玻片的六孔培养板中，待生长至接近融合，分别以不同浓度的 GEN 预先孵育 12 h 后，再加入 HCY 5.0 mmol/L 刺激 2 h，其余按提示操作，在 Nikon E800 光
11、学显微镜下（400）下观察细胞 NF B p65 蛋白表达情况。1.3 统计学处理计量资料采用 xs 表示,并采用 ANOVA 分析，两两比较用 q 检验。对图片的图像采集、分析采用 SPOT ADVANCE 和 Image J 软件，Western 印迹图片采用Bandscan5.0 统计分析软件。 2 结 果2.1 HCY 使 ECV 304 细胞受损 HCY（5.0 mmol/L）处理组活性最低（P0.01），随着 GEN 浓度由低到高，细胞活性也显著升高，至 GEN 100 mol/L组活性与对照组已无统计学意义（P0.05)，见表 1。说明此剂量的 HCY 可使内皮细胞受到损伤，活性
12、下降，而不同浓度的 GEN 却可以抑制 HCY 这种损伤作用，经相关分析发现随着 GEN 浓度的增高，细胞活力增加，且呈剂量依赖性（r=0.93，P0.05）。表 1 GEN 对 HCY 诱导的 ECV 304 细胞活性降低的影响(略)2.2 Western 印迹法检测 NF B p65 的表达水平5.0 mmol/L 的 HCY 单独处理后，NF B p65 蛋白与对照组（6.39%0.85）相比，灰度值明显增高（62.24%14.39%）（P0.05）；而预先用不同浓度的 GEN 孵育5后，再加入 5.0 mmol/L 的 HCY 刺激 2 h，NF Bp65 电泳条带灰度值有不同程度的降
13、低，尤其是 100 mol/L 的 GEN 组（5.61%0.97%），与对照组相比无明显差异（P0.05），与 HCY 5.0 mmol/L 组相比，有显著差异（P0.01）。表明 GEN 能阻断 HCY 上调 NF B p65 蛋白的表达，且具有剂量依赖性（r=-0.95，P0.05）。2.3 免疫组化检测 NF B p65 蛋白表达情况见图 1。阳性结果显示染色为棕黄色细颗粒状。阴性结果为空白对照组 PBS 代替一抗的细胞，可见胞核呈深蓝色，胞浆透明，无棕色颗粒；正常对照组可见较弱的胞浆黄染，5.0 mmol/L HCY 处理 2 h 后，可见 ECV 304 细胞质及核出现黄染现象，N
14、F B p65 大量表达，活性增高。经不同浓度的 GEN 处理后，细胞阳性颗粒均有不同程度的降低，表明 GEN 对 HCY 所引起的 ECV 304 NF B 活性增高有抑制作用。3 讨 论HCY 属含硫氨基酸，体内不能合成，其作为致 AS 性血管病的一种危险因素倍受重视，有研究表明5，高 HCY 诱导的氧化应激反应产生的氧自由基可能导致内皮细胞结构和功能异常，参与 AS 过程。GEN 化学名为 4，5，7 三羟异黄酮，结构与维生素 E 相似，是大豆异黄酮的主要活性成分，具有抗氧化作用6，能降低脂质过氧化物代谢产物水平，从而降低内皮细胞氧化损伤的程度，提高其活力，改善血管内皮功能2。对于防止早
15、期 AS 及慢性血管疾病等多种药理作用及生物活性。研究表明，AS 的发生发展与 NF B 被激活有关7，参与粥样硬化斑块形成中的炎症反应相关基因多为 NF B 的靶基因，NF B 家族成员间可形成同源或6异源二聚体，其中最丰富的二聚体为 p50/p65 异源二聚体，几乎存在于所有的细胞，故通常将 NF B 定义为 p50/p65 异源二聚体，具有广泛的生物学活性。当细胞受到外界因素刺激时，NF B p65 被释放、激活并转入细胞核内调控一系列的基因表达8，对组织细胞造成损害，进而刺激其下游产物如细胞因子、趋化因子等的表达。Ross 在 AS 病灶中，发现被激活的 NF B 能刺激其下游产物如细
16、胞因子、趋化因子等的表达9。由于内皮损伤是 AS 的始动因素，因此本研究采用HCY 所致的血管内皮细胞病理模型来进行 AS 的研究，本实验采用高 HCY 诱导内皮细胞功能紊乱，发现 HCY 处理组细胞活性下降； NF B p65 大量表达，与对照组相比有统计学意义，而不同浓度的 GEN 却可以抑制 HCY 这种损伤，起到一定的保护作用，随着 GEN 浓度由低到高，细胞活性显著升高，至 GEN 100 mol/L 组活性与对照组已无显著性差异，同时 NF B p65 表达水平也降低。由此可以推测，HCY 可以激活 NF B，上调相关炎症因子的水平，从而加速 AS 进程，而 GEN 对这一损伤具有一定的保护作用，这一保护作用有可能通过 GEN 的抗氧化作用来实现10，11，也有可能通过其他途径。综上所述，本研究推断 HCY 致内皮细胞氧化损伤、致 AS 的机制之一可能是
