《重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移和表达的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移和表达的研究（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：兹互幺日期：猢、3 - , l3中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证
2、毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阒和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：隧指导教师签名：盘! 璺生( 。百两)重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞 中基因转移和表达的研究前言l 型糖尿病( T 1 D M ) 是一种由于胰岛B 细胞的自身免疫性损伤导致胰岛素分泌的绝对缺乏，而引起的代谢障碍性疾病。由于其是单一蛋白质一一胰岛素缺乏所致的代谢障碍，从而成为基因治疗的适
3、应症。通过基因转移技术将人胰岛素原基因导入糖尿病患者体内，以产生长期、稳定、按生理模式分泌的胰岛素，从而达到永久治疗的目的。但是该基因转入糖尿病患者体内或动物体内之前，必须在体外证明该重组人胰岛素原基因具有长期、稳定、按生理模式调节胰岛素分泌的能力。本实验通过把含重组人胰岛素 原基因的质粒以逆转录病毒为载体转入大鼠肝癌细胞C B R H 7 9 1 9 ，筛选出含有重组胰岛素原基因的肝癌细胞，并检测该种细胞转染后3 8 h 及转染后1 个月在不同葡萄糖浓度下其胰岛素的分泌情况。为下一步的动物水平实验打下基础。本实验的目的是：1 掌握细胞培养、复苏及冻存技术。2 掌握基因转染技术及鉴定方法。3
4、测定不同葡萄糖浓度下肝癌细胞在转染后3 8 h 及稳定表达后胰岛素的分泌情况。4 掌握从细胞中提取D N A 、P C R 扩增目的D N A 及电泳技术。材料与方法一、材料t1 大鼠肝癌细胞株C B R H 7 9 1 9 细胞，购自中科院上海细胞生物研究所。2 含有二点突变的胰岛素原基因重组质粒( G L a E ) 3 B P 一1 一I N S ：及含有三点突变的胰岛素原基因重组质粒( G L R E ) ，B P 一1 一I N S ，由本室研究人员前期实验完成。3 D 一葡萄糖、1 6 4 0 培养液、G 4 1 8 、小牛血清、培养瓶、六孔板均购自北京华美公司。P C R 试剂盒
5、购自宝生物工程( 大连) 有限公司。二、方法1 以逆转录病毒为载体将重组人胰岛素原基因转染大鼠肝癌细胞C B R H 7 9 1 9 内，并调节培养液中葡萄糖浓度 转染前2 4 h 将C B R H 7 9 1 9 细胞以1X1 0 5 孔接种于6 个6 孔培养板中( 各孔直径为3 5 r a m ) 。转染当天，准备含二点突变( I N S ：) 及三点突变 ( I N S ，) 胰岛素原基因的逆转录病毒上清和靶细胞生长用完全培养基的混合液( 4 1 0 5 e f u m 1 ) 各1 2 m l 。吸出六孔板中培养液，在培养板的各孔分别加入l m l 含有I N S ：、I N S ，转
6、染混合液各1 2 孔及作为对照组加入l m l 完全培养液6 孔。将六孔板放回培养箱培养过夜( 1 4 h ) ，每三孔补充含有不同葡萄糖浓度的1 0 0 m l L 小牛血清培养液1 5 m l ，使其葡萄糖终浓度分别为0 m m o l L 、5 m m o l L 、1 5 m m o l L 、2 5 m m o l L ，继续培养2 4 h 。2 胰岛素水平的检测转染后3 8 h 各孔取培养液0 5 m l 送内分泌实验室用化学发光法检测胰岛素水平。3 G 4 1 8 筛选阳性细胞克隆及扩大培养转染后3 8 h ，吸出原培养液，各孔均加入终浓度为4 0 0 m g L 的C 4 1
7、8 选择培养液。每日观察细胞生长情况，转染后7 天，各孔出现不同的阳性细胞克隆。吸出原培养液，将阳性细胞克隆分别移至2 4 孔板的各孔中，加入终浓度为2 0 0 m g L 的C , 4 1 8 选择培养液，继续培养。每3 d 换液。待细胞长满后，分别将其转移至2 5 m l 培养瓶中继续用终浓度为2 0 0 m g L 的G 4 1 8 选择培养液培养。4 稳定转染后，在不同葡萄糖浓度下，转染重组人胰岛素原基因的肝癌细胞胰岛素分泌水平的检测将扩大培养的含有三点突变胰岛素原基因的肝癌细胞( C B I N s ，) 及含有二点突变的胰岛素原基因的肝癌细胞( C B I N S ：) 及未转染胰
8、岛素原基因的肝癌细胞( c B ) 分别按一定的浓度( 3 2 5 1 0 5 ) 接种于6 个六孔板中，含有转染胰岛紊原基因的肝癌细胞用含有G 4 1 8 的选择培养液培养，而未转染胰岛素原基因的肝癌细胞用1 0 0 m l L 小牛血清的1 6 4 0 培养液培养。2 待各孔细胞接近8 0 汇片时，各孔分别加入含有D 一葡萄糖O m m o l L ，5 m m o l L ，1 5 m m o l L ，2 5 m m o l L 的1 0 0 m l L 小牛血清培养液，2 4 h 后，各孔取0 5 m l 培养液送内分泌实验室检测胰岛素水平。5 细胞染色体D N A 的提取用酚一氯仿
9、一异戊醇抽提D N A 的方法分别从C B I N S ，及C B I N S ：及 C B 中提取细胞染色体D N A 。6 P C R 扩增及电泳检测基因整合反应体系为2 5 止，循环条件：9 4 预变性5 r a i n ，9 4 变性3 0 s ，5 5 退火3 0 s ，7 2 延伸l m i n ，3 5 个循环之后7 2 延件5 r a i n 。P C R 反应后行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用银染的方法显谱。7 数据处理所测数据用S P S S1 1 0 统计软件包的成组设计的方差分析方法( O n e W a yA N O V A 过程) 进行两两比较。实验结果1 重组人胰岛素原基
10、因转染肝癌细胞3 8 h 胰岛素水平检测1 1C B I N S ：在0 1 5m m o l L 葡萄糖浓度时均未测出胰岛素分泌，在2 5m m o l L 葡萄糖浓度时胰岛素分泌量为( 2 I o 0 2 3 ) i u L 。1 2C B I N S 3 在葡萄糖浓度为Om m o l L ，5m m o l Y L ，1 5m m o l L ，2 5n u n o l L ，胰岛素分泌量分别为( 5 。0 3 0 7 2 ) i u L ，( 9 5 74 - 0 4 9 ) i u L ，( 3 2 6 0 1 9 6 ) i l l L ，( 4 3 9 0 2 。3 0 ) i
11、 u L ；各组间差异有显著统计学意义( P 均 0 0 5 ) 。结果见图12 大鼠肝癌C B R I - 1 7 9 1 9 阳性克隆形成 未转染重组胰岛紊原基因的大鼠肝癌细胞在加C A l 8 后3 d 内均死亡，而转染重组胰岛素原基因的肝癌细胞形成多个克隆。图3 是其中的2 个克隆。3 重组人胰岛紊原基因转染肝癌细胞稳定表达后胰岛寨水平检测将阳性克隆细胞经扩大培养后1 个月，C B I N S ：在0 1 5m m o V L 葡萄糖浓度时未测到胰岛素分泌，在2 5 m m o l L 时胰岛素分泌量为( 2 0 5 0 1 7 ) L 。c B I N S 3 在上述葡萄糖浓度下，胰
12、岛素分泌量分别为( 3 ，5 7 0 ，2 i ) i u L ，( 5 3 0 O 2 0 ) i u L ，( 1 6 2 7 0 8 7 ) i u L ，( 2 3 2 3 1 1 2 ) i u L ，各3 组问差异有显著性意义( P 0 0 5 ) 。结果见图44 基因整合的鉴定 用P C R 扩增及电泳鉴定重组人胰岛素原基因的整合情况：经扩大培养的细胞基因组都扩增出一特异的长9 7 0 b p 的目的基因片断电泳条带，而未 转染细胞基因组则无此条带( 结果见图5 ) ，证明重组质粒已在细胞基因组上稳定整合。讨论1 型糖尿病常需胰岛素治疗，若能在患者的胰外组织建立呈生理模式调控的胰
13、岛素分泌将是治疗l 型糖尿病的理想疗法。利用基因工程技术将重组人胰岛素原基因转入非B 细胞，发展1 3 细胞替代物，及使这种替代物 能够进行生理模式的胰岛素分泌使这种疗法成为可能。以非B 细胞为靶细胞的胰岛素原基因治疗应很好的实现以下二个环节：转染的细胞有合适的酶学生化机制，可以将胰岛素原正确处理为成熟的、有生物活性的胰岛索。对葡萄糖及胰岛素敏感的胰岛素表达调节系统，使胰岛素原基因的转录和翻译对葡萄糖浓度改变做出正确的反应，同时过高的胰岛素水平能抑制其释放胰岛素。第一个环节本实验室已经成功实现，成功提取胰岛素原基因，并将其突变为能被非1 3 细胞内普遍存在的f u r i n 酶识别并裂解的胰
14、岛素原基因。突变为f u r i n 酶可识别的序列后，可产生有活性的成熟的胰岛素。目前大多采用二点突变，即在人胰岛素原基因B C 连接处及C A 连接处进行定点突变。而我们是在上述两点突变的基础上，再次进行第三点 突变，即将B 链第十位组氨酸突变为天冬氨酸，这一过程由本组人员前期完成。本实验将含有突变人胰岛紊原基因二种重组质粒转染到大鼠肝癌细胞，显示出三点突变胰岛素分泌量比二点突变者增加约2 3 倍。第二个环节即胰岛素释放的调控问题是目前研究的热点问题。本实验采用逆转录病毒为载体进行转染，将重组胰岛素原基因转移到大鼠肝癌细胞内，使其成为能够分泌胰岛素的细胞。我们采用大鼠肝丙酮酸羧激酶( LP
15、 K ) 基因启动子中的3 个拷贝的葡萄糖反应元件( G L R E ) ，和胰岛素样生 长因子结合蛋白一1 ( I G F B P 1 ) 作为胰岛素原基因的调控因子，使该重组胰岛紊原基因的表达和调控受葡萄糖和胰岛素的双重控制。结果证实了胰岛素原基因的表达受葡萄糖的调节。肝丙酮酸羧激酶( L P K ) 基因启动子4 中的葡萄糖反应元件( g u - 砸) 主要在肝脏表达，而正常肝细胞只能做原代培养，由于经济及实验条件所限，我们采用了大鼠的肝癌细胞C B R H 7 9 1 9 细胞系作为靶细胞。由于外源基因在这一细胞系被成功地转入和表达，且有易于培养和增殖等优点而被采纳，它也是目前基因研究
16、常用的靶细胞之。结果显示转染重组人胰岛素原基因后，C B R H 7 9 1 9 细胞能够分泌胰岛素艮分泌的胰岛索水平在一定的葡萄糖浓度内( O 一2 5 r e t o o l L ) 随葡萄糖浓度的升高而增多。这个葡萄糖浓度范围也是人或糖尿病鼠动物模型经常测到的葡萄糖值。目前大多数研究转染的细胞表达胰岛素只是瞬时表达，而本研究不仅证明了重组的胰岛素原基因能够使瞬时胰岛素的分泌受葡萄糖的反应性调节，并把胰岛素原基因稳定整合在肝癌细胞染色体内，使该基因能够在宿主细胞长期受葡萄糖调控表达。这就为下一步动物实验奠定了理论及实践基础。结论1 采用逆转录病毒为载体能将重组人胰岛素原因转染到肝癌细胞中，并能使之在靶细胞内稳定表达。2 重组胰岛素原基因在体外能指导靶细胞随着葡萄糖浓度的变化调节胰岛素的分泌。岛素关键词1 型糖尿病；重组人胰岛素原基因；逆转录病
