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1、1内皮细胞相关黏附分子的研究进展【摘要】 白细胞黏附于血管内皮细胞并渗出内皮细胞层是免疫反应的关键和重要步骤。此过程不仅需要激活白细胞及其膜表面黏附分子, 而且需要内皮细胞上相关的黏附分子的调控。目前研究已由研究黏附生理过程转向研究此过程的分子机制。本文主要介绍与此过程相关的内皮细胞黏附分子的基因表达、 信号转导通路调控以及对细胞功能的影响等的最新研究进展。 【关键词】 内皮细胞; 细胞黏附分子; 白细胞渗出; 信号转导白细胞黏附血管内皮细胞并渗出内皮细胞层 (transendothelial migration, TEM) 是免疫反应的关键步骤。而细胞黏附分子不仅可以调节细胞和细胞间相互作用
2、、 细胞和细胞基质之间的黏附, 在细胞对周围环境的反应过程中也起重要的调节作用。研究发现, 白细胞黏附并渗出内皮细胞过程中, 内皮细胞的激活及细胞膜表面相关黏附分子的表达和调控必不可少, 如 ICAM 1(intercellular adhesion molecule 1)和 VCAM 1(vascular cell adhesion molecule 1)等。它们不但能够通过改变内皮细胞层的透过性来实现短时间的渗出效应, 并且能够激活下游相关信号通路来调节蛋白的转录和翻译, 实现长时间的渗出效应, 这些过程不但需要调节胞质内钙离子浓度和肌动蛋白纤维的构型, 而且需要一些小的 GTPase、
3、ROS (reactive oxygen species) 和一些相关蛋白激酶的参与1, 2。1 内皮细胞黏附分子及其在 TEM 中的作用白细胞黏附并渗出血管内皮细胞可分为四步: 初次黏附 (tethering and rolling, primary adhesion) , 白细胞的激活 (activation), 紧密黏附 (tight adhesion, 2secondary adhesion)和渗出 (diapedesis)。其中, 在初次黏附过程中, 主要是通过内皮细胞表面的 E selectin、 P selectin 和 CD34 与淋巴细胞上 ESL 1、 PSGL 1和 L
4、selectin 糖基相连, 使白细胞降低其流动速度并在内皮细胞层表面旋转。于此同时, 选择素的连接和聚集会激活白细胞内相应信号通路的变化而使其释放一些炎症介质分子, 如趋化因子(chemokine)、 细胞因子(cytokine)等, 激活整合素使得白细胞与内皮细胞更容易发生紧密黏附。紧密黏附主要是白细胞膜表面上整合素如 VLA 4, LFA 1 等与内皮细胞表面上的免疫球蛋白超家族如 VCAM 1 和ICAM 1 相结合3。最后白细胞通过细胞旁途径 (paracellular pathway)或者跨细胞途径 (transcellular pathway)渗出内皮细胞层到达炎症部位, 细胞旁
5、途径中有 6种细胞黏附分子如 VE cadherin、 PECAM 1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule 1)、 CD99、 JAM A、 JAM B 和 JAM C (junctional adhesion molecule A, B, C)等在其中起重要的调控作用, 而对于跨细胞途径其机制目前仍不太清楚, 但有研究表明其需要 ICAM 1 介导4。并且有研究证实, 在整个过程中 ICAM 1 的聚集可影响其他黏附分子的表达量, 从而推测 ICAM 1 在整个 TEM 过程中起核心调节作用5。2 内皮细胞黏附分子调控的分子机制白细胞如要
6、成功渗出内皮细胞层需要相应黏附分子的表达, 而黏附分子会启动其下游的一些细胞信号通路, 这种具体的分子调控机制是当前研究热点和关键。许多黏附分子都具有跨膜的结构, 由胞外区、 跨膜区和膜内区构成。其胞外区通常有与整合素等相应受体相结合的结构位点, 而膜内区则含有磷酸化位点或者与细胞骨架蛋白相连, 一旦胞外区被激活则会引起膜内区结构的变化从而影响下游信号通路。如 ICAM 1 和 VCAM 1 富含与 F actin 相连的结构, 这种结构能延3伸至细胞膜外与淋巴细胞相连6。2.1 E selectin(CD62 E) 选择素家族除了可以介导初次黏附, 并使得白细胞在内皮细胞表面旋转; 它们与其
7、受体的结合也能够启动其下游的信号通路。当中性粒细胞和记忆性 T 淋巴细胞渗出内皮细胞时, E selectin 的膜内区尾部结构与Ras 结合, 酪氨酸磷酸化其下游 Raf 和 MEK 蛋白, 激活 p42MAPK/ERK 信号通路来调控 c fos 的活性, 并且发现 E selectin 还可以影响肌动蛋白骨架的构型, 但具体机制仍不清楚。进一步研究发现酪氨酸磷酸化是通过补充和激活E selectin 的胞质区尾部 SHP 2 磷酸酶, 进而激活 Shc 和 Grb2 调节蛋白, 从而调控 Ras MAPK 信号通路2。并且 E selectin 可停留在含有小窝蛋白的脂筏中(caveol
8、in containing lipid rafts), 并与磷脂酶 C 相结合。当脂筏破裂时, 会抑制磷脂酶 C 的活化, 但对 MAPK 没有影响。由此可见, 不同的膜的结构域可调控不同的信号转导通路7。2.2 ICAM 1(CD54) ICAM 1 是白细胞渗出内皮细胞层过程中最核心的分子, 尤其是在淋巴细胞和中性粒细胞的渗出过程中。内皮细胞正常情况下 ICAM 1表达量较低, 在炎症反应中其表达量显著升高8。ICAM 1 主要通过其膜内区尾部 C 末端 29 个氨基酸的结构来调节下游信号通路。这种结构与 EMR (ezrin, moesin, radixin)蛋白和 辅肌动蛋白相连。当
9、ICAM 1 被激活后, 一方面其可以激活 p60src 激酶, 导致人皮层肌动蛋白(cortactin)磷酸化, 从而引起胞质内钙离子的下降从而激活 Rho 蛋白激酶, 最后导致细胞肌动蛋白收缩, 内皮细胞收缩性变大。另一方面 ICAM 1 能够通过激活黄嘌呤氧化酶来激活 p60src, 并且通过SHP2 依赖性途径使得 ezrin 和 p38 MAPK 上酪氨酸磷酸化, 从而影响肌动蛋白的4应力构型9。由此可见, ICAM 1 的激活可增加内皮细胞层的透过性, 从而导致白细胞更容易渗出。另一方面, ICAM 1 的聚集可使得 ERK 和 JNK 磷酸化, 激活其信号通路, 并通过 fos
10、和 jun 调控相关基因的表达, 进而影响 VCAM 1、 RhoA 等的表达。2.3 VCAM 1(CD106) VCAM 1 是整合素 VLA 4(41)在内皮细胞上的受体, 正常条件下内皮细胞中不表达, 炎症刺激后才开始表达。VCAM 1 的膜内区尾部有一个由 19 个氨基酸构成的位点可作为与型 PDZ 结合的基序, 已经证实这 19个氨基酸位点可以与 ezrin 和 moesin 结合来调控下游信号通路, 然而对于型PDZ 结合基序的作用仍然不清楚6。VCAM 1 的聚集可以激活 Rac1 蛋白, 从而使活性氧家族 ROS(reactive oxygen species)表达量增加,
11、从而激活 p38MAPK 信号通路并且改变肌动蛋白纤维的应力结构。VCAM 1 也可以通过激活 Rho 蛋白来启动下游信号通路5。由于 ROS 可以修复内皮细胞间的黏附, 并且可以通过间接刺激酪氨酸激酶的活性来调控内皮细胞的整合性。ROS 还能够通过调节MMP 的活性, 影响 VE 钙调素的活性, 从而控制内皮细胞间连接的紧密程度, 调控白细胞渗出。而 Rac 可通过内皮细胞膜表面上的 NOX2(the NADPH oxidase 2)来调节细胞外的 ROS 的浓度。因此, VCAM 1 与 VLA 4 的结合可通过Rac ROS 通路来控制白细胞向内皮细胞层的渗出10。ICAM 1 和 VC
12、AM 1 对于白细胞渗出内皮细胞层都是十分重要的, 并且由于两者在内皮细胞膜上的位置很接近, 因此当白细胞通过 1 和 2 整合素介导渗出时, 两者所引起的信号通路可能是相互联系的。但仍需进一步的研究来弄清楚其中的具体关系1。2.4 PECAM 1(CD31) PECAM 1 属于免疫球蛋白超家族, 主要通过其同源性5结合介导白细胞和内皮细胞的连接以及内皮细胞之间的相互连接。在体外实验中, 已经证实阻断 PECAM 1 与其受体结合可抑制中性粒细胞和淋巴细胞的渗出。与其他免疫球蛋白超家族分子不同, PECAM 1 含有一个扩展的胞质区尾巴, 上面含有两个免疫受体酪氨酸抑制性基序(immunor
13、eceptor tyrosine based inhibition motifs, ITIM), 它们在类 src 蛋白激酶作用下, 易发生酪氨酸磷酸化, 进而对细胞刺激和 PECAM 1 的同源性结合起主要的反应11。后续研究进一步表明, 这种免疫受体酪氨酸抑制性基序主要通过与 SHP 1 和 SHP 2 上的酪氨酸磷酸酶、 SHIP 功能区(SH2 domain containing inositol 5 phosphatase)和 Grb2、 catenin、 catenin 蛋白结合进而被磷酸化, 从而启动下游信号通路。与E selectin 一样, PECAM 1 可通过其 SHP2
14、 结构域激活 MAPK 通路, 并且PECAM 1 还可通过激活 Rap1 刺激整合素的黏附。尽管 PECAM 1 所介导的信号通路的研究已经广泛的开展了, 但对于其在白细胞渗出过程中的信号转导机制仍然不清楚12。2.5 JAMs JAM 家族主要集中在内皮细胞紧密连接处, 且白细胞渗出需要JAMs 参加。研究推测 JAM 蛋白可通过 C 末端 PDZ 集合基序与 ZO1、 AF6、 Par 3 和 MUPP1 蛋白结合来调控相关信号通路进而调节内皮细胞极性和内皮细胞之间的连接, 但 JAMs 在白细胞渗出过程中具体的信号调控机制仍不清楚13。近年来, 随着白细胞渗出内皮细胞层相关研究的逐步深
15、入, 已经证实这种渗出过程的分子调控机制是十分复杂的, 它们形成了一种网络化的结构（图 1）。白细胞渗出内皮细胞层时, 内皮细胞膜表面不但会形成一种“袜子结构”, 并且通过其上的ICAM 1 与 VCAM 1 与白细胞上相应整合素结合, 启动下游信号转导通路, 引起细胞肌动蛋白收缩和内皮细胞间连接紧密程度的下降, 从而使得白细胞更容易的渗出, 但其中许多具体的作用机制尚不清楚3。 图 1 白细胞渗出内皮细胞6层信号转导图（略）3 影响因素白细胞渗出内皮细胞不但需要相应的黏附分子相识别, 而且受一些因素的影响。如白细胞的种类, 淋巴细胞、 中性粒细胞和单核细胞在渗出过程中可表达不同的黏附分子。不
16、同的炎症刺激分子, 如 TNF 、 IL 2 等可引起不同黏附分子的表达及调控14。血液流动剪切力也可引起黏附分子调控变化, 如已经证实VCAM 1、 E selectin 都具有剪切应力的依赖性, 剪切力的增大可激活 ERK2 通路, 从而引起肌动蛋白构象的变化; 同时, VE 钙调素和 PECAM 1 的活性也受剪切力影响。另外, 扰动流场附近的内皮细胞内, src 和 PI3K/Akt 通路可被激活, 从而激活 NF B 转录调控因子, 引起基因表达的变化15。4 结语目前, 有关白细胞渗出内皮细胞的研究主要集中在体外环境下, 但随着研究方法和研究条件的不断更新与进步, 已经开展部分在体内条件下的研究, 并发现体外与体内条件下, 其渗出的机制不尽相同, 如在体内条件发现了跨细胞途径。但在体内条件下具体的渗出机制还有待进一步研究。而对于一些黏附分子如PECAM 1、 JAMs、 VE 钙调素等其在渗出过程中具体的调节机制尚不清楚, 并且由于一些黏附分子介导的信号通路
