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1、1人 IL8 正义和反义真核表达载体的构 建与表达作者：牛秀珑, 王越, 屈野, 郭小芹 叶路【摘要】 目的: 构建人 IL 8 正义和反义真核表达载体。方法: RT PCR 扩增正义和反义 IL 8 基因片段后, 将其克隆入真核表达载体 pcDNA3.1(+), 通过菌落PCR、 双酶切及测序进行鉴定后, 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系 A2780 和 SKOV3 细胞中, 并用 RT PCR 和 ELISA 法检测细胞转染后 IL 8的表达水平。结果: 经验证, 重组人 IL 8 正义/反义真核表达载体构建正确。pcDNA3.1(+) ssIL 8 转染 A2780 细胞后, 其
2、 IL 8 mRNA 及蛋白表达水平均显著增加; 而 pcDNA3.1(+) asIL 8 转染 SKOV3 细胞后, 其 IL 8 分泌水平降低。结论: 成功构建了人 IL 8 正义/反义真核表达质粒 pcDNA3.1(+)ssIL 8/pcDNA3.1(+) asIL 8, 为后续研究 IL 8 在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础。 【关键词】 IL 8; 正义/反义; 真核表达载体; 卵巢癌细胞Abstract AIM: To construct the sense or antisense IL 8 eukaryotic expression vectors. METHODS: Sen
3、se or antisense IL 8 full length gene were amplified by RT PCR and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After the identification by PCR, restriction endonuclease digestion and the nucleotide sequencing, the recombinant vectors were transfected into human ovarian carcinoma A2780 and
4、SKOV3 cell lines transiently by lipofectamine mediation. The expression of IL 8 gene and protein were detected by RT PCR and ELISA. RESULTS: The sense or antisense IL 8 eukaryotic expression vectors were constructed and verified. The expression of IL 8 gene and protein in A2780 cells transfected wit
5、h pcDNA3.1(+) ssIL 8 were increased, whereas the expression of IL 8 protein in SKOV3 cells transfected with pcDNA3.1(+) asIL 8 was decreased. CONCLUSION: The eukaryotic expression vectors pcDNA3.1(+) ssIL 8 or pcDNA3.1(+) asIL 8 2have been constructed successfully, which lays a base for further stud
6、y on roles of IL 8 in ovarian cancer and other tumors.KeywordsIL 8; sense or antisense; eukaryotic expression vector; ovarian carcinoma cellsIL 8 是一种多功能的趋化因子, 可参与多种恶性肿瘤的生长、 转移及血管生成。近年来研究表明1, 2, IL 8 在卵巢癌中高表达, 其高表达可能与卵巢癌发生、 发展及化疗关系密切。我们前期研究发现3, 4, IL 8 及雌、 雄激素均可促进卵巢癌细胞增殖; IL 8 还可在无雌、 雄激素的条件下调节卵巢癌细胞表达
7、雌、 雄激素的受体, 从而增加该细胞对两种激素的敏感性。为了深入探讨 IL 8 在卵巢癌发生、 发展及化疗和内分泌治疗中的作用及作用机制, 我们应用基因重组技术, 成功构建人 IL 8 正义(sense, ss)和反义(antisense, as)真核表达载体, 从而为后续研究 IL 8 在卵巢癌及其他肿瘤中的作用及作用机制奠定基础。1 材料和方法1.1 材料 TOP10 感受态细菌购自北京天根生物公司; 真核表达载体pcDNA3.1(+)为美国 Invitrogen 公司产品, 由本室保存。人卵巢癌细胞系 A2780和 SKOV3 细胞均为美国 ATCC 公司产品, 由本室保存。RPMI16
8、40 培养基为美国 Gibco 公司产品; 2Premix Taq、 M MLV 逆转录酶、 BamH、 Xho为TaKaRa 公司产品; T4 DNA 连接酶为美国 NEB 公司产品、 DNA 胶回收试剂盒为加拿大 Bio Basic 公司产品; 人 IL 8 ELISA 试剂盒为美国 RD 公司产品; Opti MEM、 LipofectamineTM 2000、 TRIzol 试剂为美国 Invitrogen 公司产品; 100 bp 和 1 kb DNA Marker、 高纯度质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。1.2 方法31.2.1 引物设计 人 IL 8 全长编码基因扩增用引物,
9、 参照 GenBank 数据库(NM 000584.2), 采用 DNAMAN 软件设计, sense IL 8 引物, F: 5 CTCGGATCCATGACTTCCAAGCTGGCCGTG 3(划线部分为 BamH酶切位点), R: 5 AGACTCGAGTTATGAATTCTCAGCCCTCTT 3(划线部分为Xho酶切位点); 目的片段 318 bp。antisense IL 8 引物, F: 5 CTCGGATCCATGTGAATTCTCAGCCCTCTT 3(划线部分为 BamH酶切位点), R: 5 AGACTCGAGTTAACTTCCAAGCTGGCCGTG 3(划线部分为Xh
10、o酶切位点), 目的片段 318 bp。1.2.2 目的基因的扩增 自 SKOV3 细胞中提取总 RNA 作为逆转录模板, 采用RT PCR 方法扩增 IL 8 正义全长目的基因片段。逆转录反应条件参照 TaKaRa M MLV 逆转录酶说明书进行, 逆转录产生的 cDNA 经 PCR 扩增获得约 300 bp大小的目的片段(引物序列见 1.2.1)。50 L IL 8 正义 PCR 产物经 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳后, 按照 DNA 胶回收试剂盒说明回收纯化 DNA 片段。以此纯化的IL 8 正义 PCR 产物为模板, 扩增 IL 8 反义全长目的基因片段(引物序列见 1.2.1)。PC
11、R 反应体系: cDNA 0.5 L, 2Premix Taq 25 L, 上、 下游引物各 25 pmol, 加双蒸水至总体积 50 L。PCR 反应条件: 94 5 min 预变性; 94 30 s 变性, 59 45 s 退火, 72 1 min 延伸, 34 个循环; 72 延伸 10 min。1.2.3 重组质粒的构建 空载体 pcDNA3.1(+)、 IL 8 正义或反义 PCR 纯化回收产物分别用 BamH和 Xho进行双酶切, 经电泳回收目的条带后定量。按照目的片段和载体片段摩尔比为 31 的原则, 用 T4 DNA 连接酶将双酶切后的目的片段和空载体进行连接, 而后转化入 T
12、OP10 感受态细菌。将转化细菌均匀涂布于4含氨苄青霉素 50 mg/L 的 LB 琼脂平板上, 倒置于 37温箱培养 12 h(过夜)。1.2.4 重组质粒的鉴定 挑取孤立菌落, 用 100 L 去离子水重悬, 作为模板, 进行菌落 PCR 扩增鉴定。PCR 反应体系为: 菌落 1 L, 2Premix Taq 10 L, 上、 下游引物各 10 pmol(引物序列见 1.2.1), 加双蒸水至总体积 20 L。PCR 反应条件同 1.2.2。经菌落 PCR 鉴定阳性的单菌落, 接种于含氨苄青霉素 100 mg/L 的 LB液体培养基中, 37恒温摇床震荡培养过夜, 按照质粒小量提取试剂盒说
13、明提取质粒, 并用 BamH 和 Xho进行双酶切鉴定。经菌落 PCR 和酶切鉴定证实有插入片段后, 将阳性菌液 2 mL 送北京天根生物公司测序, 将测序结果正确的重组载体分别命名为 pcDNA3.1(+) ssIL 8 和 pcDNA3.1(+) asIL 8。1.2.5 细胞瞬时转染 采用脂质体法将重组载体 pcDNA3.1(+) ssIL 8 或pcDNA3.1(+) asIL 8 及空载体 pcDNA3.1(+)分别导入 A2780 细胞和 SKOV3 细胞中。按照脂质体 LipofectamineTM 2000 说明书进行, 具体步骤如下: 用无抗生素、 含 100 mL/L FB
14、S 的 RPMI1640 培养液调整细胞密度为 2108/L, 每孔 2 mL加入 6 孔板, 37、 50 mL/L CO2 培养过夜。待细胞生长至 80%融合时, 更换新鲜的无抗生素、 含 100 mL/L FBS 的 RPMI1640 培养液。准备 A、 B 两液, A 液: 250 L Opti MEM, 加入 4 g 重组载体或空载体, 轻混; B 液: 250 L Opti MEM, 加入 10 L 脂质体, 轻混后室温放置 5 min。上述两液混合后, 室温放置 20 min, 加入到每孔细胞中, 37、 50 mL/L CO2 培养 6 h 后, 更换无抗生素、 含 100 m
15、L/L FBS 的 RPMI1640 培养液, 每孔 2 mL。转染细胞分别命名为pcDNA3.1(+)/A2780、 pcDNA3.1(+) ssIL 8/A2780 和 pcDNA3.1(+)/SKOV3、 pcDNA3.1(+) asIL 8/SKOV3。 1.2.6 细胞转染后 IL 8 表达水平的检测 转染后 24 h, 采用 ELISA 法检测上清中 IL 8 的含量; 同时收集细胞, 抽提 RNA 后分5别以 IL 8 的特异性引物进行 RT PCR 反应。引物序列如下: IL 8, F: 5 AACATGACTTCCAAGCTGGCCG 3, R: 5 CAGTTTTCCTTG
16、GGGTCCAGAC 3, 目的片段 251 bp; 内参照 GAPDH, F: 5 CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA 3, R: 5 ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA 3, 目的片段 450 bp。PCR 反应体系: cDNA 1.0 L, 2Premix Taq 10 L, 上、 下游引物各 10 pmol, 加双蒸水至总体积20 L。PCR 反应条件: 94 5 min 预变性; 94 30 s 变性, 59 45 s 退火, 72 1 min 延伸, 34 个循环; 72 延伸 10 min。反应结束后, 取 PCR 反应液 5 L 于 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳。2 结果2.1 正义和反义 IL 8 全长基因片段扩增 以 SKOV3 细胞的总 RNA 为模板, 应用前述引物进行 RT PCR, 将扩增产物进行 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳(图 1), 可见 300 bp
