MCP1基因A2518G多态性与不稳定性心绞痛关系的初步分析

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1、1MCP1 基因 A2518G 多态性与不稳定 性心绞痛关系的初步分析作者：师干伟，何国平，戚传平，高磊，戚猛，沈丹丹，钱志宏，许联红【摘要】 目的： 探讨中国苏南地区汉族人群单核细胞趋化蛋白 1（MCP 1）基因启动子 A 2518G 单核苷酸多态性与不稳定性心绞痛（UAP）的相关性。方法： 采用病例 对照研究方法，选择临床确诊的 UAP 患者 172 例为病例组和经冠脉造影检查证实无冠脉病变者 156 例为对照组。利用聚合酶链式反应 限制性酶切片段长度多态性技术（PCR RFLP）对 MCP 1 基因 A 2518G 行多态性检测，并统计各基因型及等位基因的频率分布。结果： 与对照组相比，

2、UAP 组的 AA，AG 和GG 基因型频率差异均无统计学意义（P 值分别为 0.067，0.825 和 0.281）。G 等位基因频率在 UAP 组和对照组分别为 54.36%和 61.22%，两组间差异无统计学意义（P=0.069）。对多个相关因素行多元 Logistic 回归分析显示，MCP 1 基因A 2518G 单核苷酸多态性与 UAP 的发病无相关性（P0.05）。结论： 在中国苏南地区汉族人群中，MCP 1 基因 A 2518G 单核苷酸多态性与 UAP 无显著相关性。 【关键词】 不稳定性心绞痛； 单核细胞趋化蛋白 1； 单核苷酸多态性AbstractObjective: To

3、 investigate the possible association between the monocyte chemoattractant protein 1(MCP 1) gene A 2518G single nucleotide polymorphism(SNPs) in the promoter region with unstable angina pectoris(UAP) in Chinese Han population of Sunan region. Methods： This study was conducted with a case control des

4、ign including 172 patients with UAP(UAP group) and 156 control subjects who were free from coronary artery disease by Coronary Angiography checks(control group). Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCR RFLP) was used for the detection of the A 2518G polymorphism in MCP

5、 1 gene，and then the frequency of genetype was statistically 2analyzed. Results： Compared with the control group, the frequencies of AA，AG and GG genotype were not significantly different in UAP group(P was 0.067，0.825 and 0.281, respectively). The prevalence of G allele was 54.36% and 61.22% respec

6、tively in the UAP group and control group; there was no difference between them in statistics(P=0.069). Multivariate logistic regression analysis indicated that there was no significant correlation between MCP 1 gene A 2518G polymorphism with UAP(P0.05). Conclusion： Our data shows that MCP 1 gene A

7、2518G polymorphism is not associated with the risk of UAP in the Chinese Han population of Suwan region.Key wordsunstable angina pectoris; monocyte chemoattractant protein 1; single nucleotide polymorphism不稳定性心绞痛( unstable angina pectoris, UAP)主要是冠状动脉内粥样斑块不稳定而引起血栓形成、管腔闭塞所导致急性心肌缺血的一组临床症状。病理学研究显示，在易损斑

8、块内可见炎性细胞（主要是巨噬细胞）浸润。已有研究表明，单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)基因启动子区 A 2518G 单核苷酸多态性与血清 MCP 1浓度1,2和冠心病均存在相关性1,3，但其他关于该位点单核苷酸多态性与心血管疾病易感性的研究结果并不完全一致4,5。基于上述研究背景，本研究以苏南地区汉族人群为研究对象，对 UAP 患者的 MCP 1 基因 A 2518G 单核苷酸多态性进行分析。1 资料与方法1.1 研究对象所有入选者均为 2005 年 6 月至 2009 年 6 月期间在江苏大学附属武进医院心内科的住院患者。其中确诊为 UAP 者（UAP 组）172 例，男 119 例，女

9、53 例，年龄 3085（65.57 10.55）岁，均符合 2002 年 AHA/ACC 关于 UAP 的诊断标准，并有2 名或 2 名以上医师共同诊断，其中 1 名为主治或主治以上医师。选择同期住院3并行冠状动脉造影排除冠状动脉病变者（对照组）156 例，男 73 例，女 83 例，年龄3076（55.8011.70）岁。所有研究对象排除严重肝肾功能不全、肿瘤、风湿类疾病和急性或严重慢性感染者。该研究经本院医学伦理委员会批准，并征得所有入选对象知情同意。 1.2 研究方法1.2.1 一般资料采集使用统一表格记录所有入选对象的基本资料，包括年龄、性别、吸烟史、高血压史、糖尿病史、家族史、血脂

10、、血糖和冠状动脉造影等结果。1.2.2 基因多态性检测1.2.2.1 DNA 提取入选对象禁食 1214 h 后抽取外周静脉血 5 ml 置入 EDTA 抗凝管，按照下列步骤提取 DNA：（1）在离心机中离心后采用低渗液裂解红细胞；（2）离心机离心后分离出白细胞，加入蛋白酶 K 后 37水浴过夜消化；（3）采用经典的酚 氯仿法提取白细胞基因组 DNA，置于 70冰箱保存备用。1.2.2.2 引物设计和合成根文献3和 MCP 1 基因 GenBank 注册号设计引物。上游引物：5 TCTCTCACGCCAGCACTGACC 3，下游引物：5 GAGTGTTCACATAGGCTTCTG 3（引物由

11、大连宝生物公司合成）。扩增目的片段大小为 234 bp。41.2.2.3 PCR 扩增与基因分型采用聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性方法（PCR RFLP）进行基因型分型。第一步行 PCR 扩增：（1）扩增体系：反应总体积为 25 l，其中包括热启动混合 Taq 酶 12.5 l（由大连宝生物公司提供）、DNA 模板 1 l、引物(浓度 10 mol/L)各 0.5 l 和去离子水 10.5 l。 （2）扩增条件：95预变性 5 min；然后以 95 40 s，60 30 s 和 72 40 s 共行 35 个循环，最后 72延伸 10 min。 （3）检测目的片段：扩增结束后，取 4 l

12、 PCR 扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶中电泳 10 min，确定 PCR产物为所需要的目的片段（234 bp）。第二步对目的片段行限制性酶切：（1）酶切反应体系：反应总体积为 20 l，其中包括 PCR 产物 10 l，Pvu内切酶 1 l（由大连宝生物公司提供）、缓冲液 2 l 和去离子水 7 l。 （2）酶切反应条件：37水浴酶切过夜。第三步基因分型：取酶切产物 10 l 加 6DNA 上样缓冲液 1.5 l，在含胶红染料的 2%琼脂糖凝胶中电泳 30 min，然后在紫外线凝胶成像仪中观察、记录并保存电泳结果。 （3）抽样检测目的片段：抽样回收目的 DNA 片段送大连宝生物公司行基因测序

13、，进一步验证目的片段。1.2.3 血脂检测包括血总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL）等，以上生化指标均由江苏大学附属武进医院检验中心在自动生化分析仪上统一测定。1.2.4 统计分析采用 SPSS 10.0 软件进行统计分析。计量资料以s 表示，组间比较采用 t 检验；5基因型和等位基因频率分布采用直接计数法统计；计数资料比较采用 2 检验，关联程度用优势比（odds ratio, OR）和 95%可信区间（confidence interval, CI）表示；多种相关因素分析采用 Logistic 回归分析；以 P0.05 为差异有统计

14、学意义。2 结 果2.1 UAP 组与对照组的临床资料比较与对照组相比，UAP 组年龄较大，男性、吸烟者和合并糖尿病者较多，血清TC，TG 和 LDL 水平明显增高（表 1）。表 1 UAP 组和对照组一般临床资料比较（略）2.2 基因分型MCP 1 基因 A 2518G 多态位点经 PCR 扩增后获得大小为 234 bp 目的片段，如有 AG 替换，则产生 Pvu内切酶酶切位点，因此，PCR 产物经 Pvu内切酶消化，可在琼脂糖凝胶电泳中观察到 3 种基因型，即 AA 纯合型（234 bp），AG 杂合型（234 bp，159 bp 和 75 bp）和 GG 纯合型（159 bp 和 75

15、bp）（图 1）。PCR 产物经测序进一步验证（图 2）。2.3 基因多态性分析MCP 1 基因 A 2518G 单核苷酸多态性在 UAP 组和对照组中均存在 AA，AG和 GG 基因型；两组间的 3 种基因型频率分布和 G 等位基因频率比较均无统计学意义（表 2）；经多因素 Logistic 分析，未发现这 3 种基因型与 UAP 的发病存在相关性（表 3）。表 2 UAP 组与对照组 MCP 1 基因 A 2518G 多态性基因型及等位基因频率的比较（略）表 3 MCP 1 基因 A 2518G 多态性基因型与 UAP 的关系6（略） 3 讨 论冠状动脉内粥样斑块的不稳定是 UAP 的主要

16、发病机制，其中炎症反应可能是导致斑块破裂的一个重要因素6。MCP 1 作为一种重要的炎症趋化蛋白，主要趋化血液中的单核细胞进入血管内皮下，从而参与了动脉粥样硬化形成；同时单核/巨噬细胞在动脉粥样斑块进展过程中分泌基质蛋白酶，破坏纤维帽结构，最终导致粥样斑块的破裂7。已有研究报道，血清 MCP 1 浓度升高与急性冠脉综合征（ACS）发病密切相关8。近年来，随着分子遗传学的发展，从基因水平研究MCP 1 与冠心病的关系已成为热点。有文献显示，MCP 1 基因启动子区 A 2518G 单核苷酸多态性 GG 基因型与血清 MCP 1 水平成正相关1,2。然而，在不同的研究中，该基因单核苷酸多态性与心血管疾病的发病关系尚存在争议1,3-5。本研究对 328 例中国苏南地区汉族人采用 PCR RFLP 检测了 MCP 1 基因A 2518G 单核苷酸多态性，发现其表现为 AA，AG 和 GG 3 种基因型。其中，经冠状动脉造影证实的健康对照组