《mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1mFSHR 基因 N 端片段的序列分析、原核 表达载体构建及其表达作者：黄海雁，文梦灵，张惠玲【摘要】 目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体(FSHR) 基因 N 端部分片段(28 90aa)(mFSHRn);预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒，并在大肠杆菌中表达。方法： 提取小鼠睾丸组织总 RNA，利用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)技术反转录成 cDNA，按照 GeneBank 中小鼠 FSHR N 端序列设计引物，扩增基因片段并插入 pET32a 载体，测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化 E. coli BL21(DE3)感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长
2、度为 186 bp, 测序结果与预期结果完全一致，生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论: mFSHRn 蛋白可作为良好的候选避孕疫苗，成功构建了 pET32a mFHSRn 原核表达重组质粒，获得可表达 mFHSRn 的大肠杆菌菌株，为后续的相关研究奠定了基础。 【关键词】 卵泡刺激素受体 ;原核 ; 表达 ;生物信息学分析Objective: To clone follicle stimulating hormone receptor gene N terminal fragment (28 90aa) (mFSHRn), and t
3、o forecast the possibility of its encoding protein being pregnancy vaccine, and to construct prokaryotic expression recombinant plasmid and express it in colibacillus. Methods： Mouse testis RNA was extracted and inversely transcribed to cDNA by means of RT PCR. The primer was designed according to m
4、ouse FSHR N terminal sequence of Genebank, and then gene fragments were amplified and pET32a vector was inserted. After sequencing, bioinformatics was analyzed. Expression protein was induced by plasmid transformation E. coli BL21 (DE3) competence strain. Results： The amplification length was 186bp,
5、 sequencing and expectation was completely concord. Bioinformatics analysis showed the encoding protein had satisfactory antigenicity. The restructuring prokaryotic expression plasmid obtained recon and induced expression.Conclusion： mFSHRn protein can be a reliable candidate of pregnancy vaccine. W
6、e successfully construct pET32a mFHSRn 2prokaryotic expression recombinant plasmid and gain mFHSRn expressing colibacillus strain, and lay a foundation for further study.KEY WORDS Follicle stimulating hormone receptor;Protocaryon; Expression; Bioinformatics analysis卵泡刺激素(follicle stimulating hormone
7、 ，FSH)是一种糖蛋白激素，通过特定的 G 蛋白偶联受体在细胞膜表面发挥作用。卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)是一种寡聚糖蛋白构成的膜受体, 4 个单体由二硫键连接，属于 G 蛋白偶联受体家族。人 FSHR 由 695 个氨基酸组成：氨基端 17 个氨基酸为疏水性信号肽;紧接信号肽的是 349 个氨基酸组成的亲水性结构区，由亮氨酸-精氨酸-精氨酸序列构成的交替 片层和 螺旋结构组成，构成 FSHR 的胞外区;接着是 264 个氨基酸构成的跨膜区，由 7 个徘徊式穿越细胞膜的疏水段组成;胞内区是 65 个氨基酸组成的羧基末
8、端。多年来，免疫避孕疫苗用于控制男性生育的研究日益增多，以几种生殖激素、激素受体和精子特异蛋白作为靶抗原为主。近年来的相关研究表明选择特异性结合靶点的多肽片段对疫苗的选择和免疫功能很重要，可以提高疫苗的特异性和免疫效果，是有前景的研究重点之一。FSH 通过 FSHR N 端上富含亮氨酸的特异性胞外跨膜结合区域结合而发挥生理作用。为明确 FSHR 的免疫避孕作用，不少学者研究了包括 FSHR 全长以及不同多肽片段的疫苗实验1 3,但疫苗的高效性、可逆性等方面仍存在不同程度的缺陷。Fan 等4报道了 FSHR 与 FSH 复合物的晶体结构模型，表明 FSHR 上 N 端半胱氨酸簇以及亮氨酸富集区(
9、LRRs)共同决定了 FSHR 结合区，并阐述了 N 端的多段肽片段是 FSHR 上的特异性结合区。另外由于目前 FSHR 市售抗体均针对 FSHR C 端设计，使其在蛋白质水平及其相关的研究受到了限制。为此，本研究对 FSHR 基因 N 端序列进行了抗原性等分析，3选择其部分片段 mFSHRn(28 90aa)进行克隆并构建了此基因的原核表达载体，在大肠杆菌中得到表达，为 FSHR N 端基因的进一步相关研究奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒和实验动物：大肠杆菌 DH5、BL21(DE3)和原核表达载体pET32a 为本实验室保存;BALB/C 小鼠，雄性，9 周龄
10、，购自南方医科大学实验动物中心。1.1.2 工具酶和试剂：限制性内切酶 EcoR和 Xho、 T4DNA 连接酶、DNA Polymerase、RNaseOUTTM 核酸酶抑制剂为 TaKaRa 公司产品;DNA 凝胶纯化试剂盒、质粒 DNA 小量抽提试剂盒为 Omega 公司产品;TRIzol 试剂、M MLV 逆转录酶为 Invitrogen 公司产品;HRP 抗 His 抗体为晶美公司产品;其他试剂均为分析纯。1.2 方法1.2.1 序列的生物信息学分析 用 Vector NTI 9.0 软件预测 FSHRn 片段编码蛋白的疏水性、柔韧性、抗原性、亲水性和极性肽段，并对其二级结构进行预测
11、分析。采用 BLAST 在线工具对鼠 FSHR 基因的核苷酸序列进行同源性比较。1.2.2 睾丸总 RNA 提取 酒精浸泡小鼠数分钟，仰面固定，取出睾丸，去除白膜与大血管， 用 TRIzol 试剂提取睾丸总 RNA，-80保存备用。1.2.3 PCR 引物设计 根据 GeneBank/NCBI:NM_013523.2 小鼠部分基因序列(28 90aa)，经 Primer Premier 5.0 软件分析设计引物：4P2：CGCCTCGAGATCTGCCTCTATTACCTCCAAG，引物 1 和 2 分别引入EcoR I、Xho I 酶切位点和保护性碱基,便于亚克隆，扩增片段长度 186 bp
12、，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。1.2.4 目的基因 PCR 产物的扩增和纯化 用 M MLV 逆转录酶合成 cDNA 第一链，20 L 体系：先将 250 ng 的随机引物、2 L 总 RNA、1 L 10 mmol/L dNTP混合物加入无核酸酶的微量离心管中，加灭菌蒸馏水至 12 L，混合物 65加热 5 min，迅速置于冰上冷却。短暂离心后加入：4 L 5第一链合成缓冲液、2 L 0.1 mol/L DTT、1 L RNaseOUTTM 核酸酶抑制剂(40 U/L);在离心管中轻轻混和各种成分，并在 37下孵育 2 min。室温下加入 1 L M MLV 逆转录酶，轻轻吹打混匀，
13、在 25下孵育 10 min,最后 37孵育 50 min。采用 20 L 反应体系，以 2 L cDNA(500 ng/L)为模板，以 945 min ;9430 s ,6030 s , 7230 s ,扩增 30 个循环;最后 72延伸 7 min 为条件扩增，PCR 产物使用 2%琼脂糖凝胶电泳观察扩增片段大小。DNA 凝胶纯化试剂盒凝胶回收扩增的 PCR 产物，-20保存备用。 1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 按分子克隆实验技术操作5。1.2.6 原核表达载体 pET32a mFSHRn 的构建 将 PCR 产物和 pET32a 载体用 EcoR、Xho双酶切，37分别酶切 12
14、 h 和 4 h。琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，回收产物用 T4DNA 连接酶按 101 摩尔体系 16 连接过夜。连接产物转化感受态的大肠杆菌 DH5, 于 100 mg/L 氨苄青霉素的 LB 平板上培养后,先进行菌落 PCR 筛选阳性克隆菌，用无菌牙签分别挑取单个菌落，浸泡在 20 L 0.1%Triton 液中置 100加热 2 min。取 2 L 作模板进行 PCR 扩增，将筛选阳性克隆菌接种于含相同浓度氨苄青霉素的 LB 液体培养基中, 37振荡培养 12 h，提5取质粒后 EcoR I、Xho I 双酶切鉴定筛选阳性克隆，最后对阳性克隆的插入片段送北京奥科生物公司测序。测序正确的质
15、粒命名为 pET32a mFSHRn。1.2.7 mFSHRn 硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白的诱导表达与鉴定 以鉴定正确的重组表达质粒转化感受态的 E. coli BL21(DE3), 取菌液涂于含 50 mg/L 氨苄青霉素的 LB 平板上, 挑取单菌落, 接种于含相同浓度的氨苄青霉素的 LB 液体培养基中, 37振荡培养过夜。按 1%转种后, 37振荡培养 45 h 至 A600 = 0.61.0，加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol /L, 继续培养 5 h，于诱导第 3、5 小时分别取 1 mL 菌液，离心收集细菌，用 TE 重悬细菌，并加适当的蛋白上样缓冲液,煮沸 15 min后
16、进行 15%的 SDS PAGE 电泳鉴定，确定有无蛋白表达。用 HIS 抗体进行Western bloting 检测6。2 结果2.1 生物信息学分析运用 Vector NTI 9.0 软件综合分析 mFSHRn 克隆片段的抗原性、柔韧性、亲水性和极性区域，并对其二级结构进行预测结果显示:抗原性区域：16 20aa，25 29aa，32 36aa，38 42aa，43 47aa，53 57aa，63 67aa;柔韧性区域：15 19aa，22 26aa，40 49aa，58 62aa;极性区域： 16 20aa，19 22aa，22 26aa，26 29aa，29 35aa，39 43aa，43 47aa，53 58aa，58 67aa;亲水性区域：11 15aa，29 39aa，41 45aa，63 67aa，66 70aa; 转角区域：15 19aa，22 27aa，44 48aa，49 53aa，60 64aa;综合以上参
