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1、1GSTM1 基因多态性与 AFB1-DNA 加合物水 平的关系作者：黄永秩，班副植，周远峰，梁秋翔，易芸，范露丹，姚利民，龙喜带【摘要】 目的探讨解毒酶基因谷胱甘肽 S-转移酶 M1(Glutathione S-transferase M1, GSTM1)多态性对黄曲霉毒素 B1(aflatoxin B1,AFB1)高污染区广西人群 AFB1-DNA 加合物水平的影响。方法采用竞争性酶联免疫吸附法检测研究对象(966 例)AFB1-DNA 加合物水平，而 GSTM1 基因型分析则通过 PCR-RFLP 来完成。结果研究结果显示 GSTM1 缺失型(GSTM1-null)与高 AFB1-DNA
2、 加合物水平相关，其校正风险值(OR)为 2.09(95%可信区间，即 95%CI 值为 1.612.71)。结论 AFB1 在带有易感基因型 GSTM1-null 的人群更易诱导产生 DNA 损伤(AFB1- DNA 加合物)。 【关键词】 AFB1;AFB1-DNA 加合物;GSTM1;多态性Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Glutathione S-transferase M1 (GSTM1) polymorphism on AFB1-DNA adducts among inhabitants highly exposure
3、 to aflatoxin B1 (AFB1) in Guangxi province.MethodsA competitive enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the AFB1-DNA adducts levels in 966 participants,the GSTM1 genotype analysis completed by using PCR-RFLP.ResultsThe data results indicated that GSTM1 deficiency (GSTM1-null)is positi
4、vely associated with elevated AFB1-DNA adducts (ajusted odds ratio, OR=2.09, 95% confidence interval, 95%CI=1.612.71).ConclusionAFB1 easily resulted in DNA injuries (AFB1-DNA adducts) among population susceptible to GSTM1-null.Key words:AFB1; AFB1-DNA adducts; GSTM1; polymorphism黄曲霉毒素 B1(aflatoxin B
5、1,AFB1)是由黄曲霉菌产生的一种人类致癌物，其在体内经细胞色素 P450(cytochrome P450， CYP)的作用转变为基因毒性产物 8,9-环氧 AFB1(8,9-epoxide AFB1，AFB1-epoxide)，后者可与 DNA 结合形成 AFB1-DNA2加合物，该加合物可经解毒酶或 DNA 修复酶清除或修复1,2。谷胱甘肽 S-转移酶 M1(Glutathione S-transferase M1, GSTM1)是一种重要的解毒酶，通过催化谷胱甘肽结合外源性毒物而在二相生物转化过程中占重要地位3。以往研究表明该基因的缺失型(即 GSTM1-null)与 AFB1 相关性
6、肝细胞癌(hepatocellular car cinoma, HCC)发病相关，提示 GSTM1 功能的缺失有助于 AFB1-DNA 加合物水平的形成411。正是基于以上认识，我们设计了以下实验以检测该多态性是否影响AFB1 高暴露区广西人群的 AFB1-DNA 加合物水平。1 对象与方法1.1 研究对象研究对象(n=966)为 2004 年 9 月2007 年 8 月间广西医科大学与右江民族医学院进行健康体检而登记的广西成年人群(年龄为 2179 岁)，经随机抽样原则而确定。所有研究对象均无肝病史，其相关信息包括年龄、性别、民族及乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染情况等的获取方式见
7、我们以前的报道4，这些具有外周血乙肝表面抗原(HBsAg)或抗 HCV 阳性者分别被定义为具有 HBV或 HCV 感染者。所有研究对象均捐赠 4ml 外周静脉血以用于 GSTM1 基因型及AFB1-DNA 加合物水平分析。该研究标准得到了医院伦理学委员会的认可与同意。1.2AFB1-DNA 加合物水平的检测检测标本为研究对象的外周血白细胞DNA，根据我们以前所介绍的方法采用竞争性酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测12，为便于分析，根据 AFB1-DNA 加合物平均水平值(1.00mol/mol DNA)将其分为 2 组，即低加合物水平组(1.00mol/mol DNA)和高加合物水平组(1.
8、01mol/mol DNA)。1.3 基因型分析鉴于 GSTM1 仅有两种基因型，即 GSTM1-null 和 GSTM1-3present，因此本研究采用以 p53 基因为阳性对照，通过多重 PCR 方法分析研究对象的 GSTM1 基因型，引物及 PCR 反应体系参见文献8，PCR 反应条件如下：94 预变性 10min，然后 94 变性 1min、60退火 45s、72 伸延 1min，重复以上45 个循环后 72 再伸延 5min。同时通过设立阳性对照、阴性对照及空白对照以控制实验质量。1.4 统计学处理采用双尾 2 检验分析 GSTM1 与 AFB1-DNA 加合物水平间的关系，通过
9、Logistic 回归分析并经性别、年龄、民族、HBsAg 及 anti-HCV 校正计算其风险值(OR)及 95%可信区间(CI)。所有分析均通过统计软件 SPSS 来完成。2 结果为确定 GSTM1 多态性是否与不同解毒及 DNA 修复能力有关(这也许能揭示基因毒性损伤水平)，本研究分析了这个基因多态性与 AFB1-DNA 加合物水平的关系(见表 1)，结果表明携 带了 GSTM1-null 的个体更可能有更高水平的AFB1-DNA 加合物(校正 OR=2.09, 95% CI=1.612.71)。表 1GSTM1 基因型与 AFB1-DNA 加合物水平3 讨论据我们所知，关于 GSTM1
10、 基因多态性对 AFB1-DNA 加合物影响的研究未见报道，更不用说来自 AFB1 高暴露区的研究。在当前研究，我们分析了来自 AFB1高暴露区的广西人群 GSTM1 和 XRCC3 基因多态性对 AFB1-DNA 加合物水平的影响，结果发现 GSTM1-null 基因型具有更高水平的 AFB1-DNA 加合物，对应OR 为 2.09，该结果揭示 GSTM1 基因多态性在 AFB1 所诱导的 DNA 损伤中具有功能性意义。GSTM1 为 GST 超家庭成员，通过催化 GST 结合外源性化学毒物而4在 II 相生物转化过程中占有重要地位3。以往研究表明 GSTM1 的缺失型即GSTM1-null
11、 缺乏酶活性，不能代谢 AFB1 的基因毒性产物 AFB1-epoxide5,7,11，而这种 AFB1 最为重要的致癌性产物能结合 DNA 导致相应加合物的形成，所形成的加合物主要有 AFB1-N7-Gua-DNA 和 AFB1-FAPy-DNA，因此，GSTM1-null应当能调节细胞内 AFB1-DNA 加合物水平。后来的研究也显示 GSTM1 多态性能影响个体外周血 AFB1-清蛋白水平5,12，例如 McGlynn 等5在调查 49 例健康男性这种基因多态性对解毒表型的影响时发现携带了 GSTM1-null 的个体比携带GSTM1-present 者有更高水平的 AFB1-清蛋白。我
12、们以前的研究4发现 GSTM1-null 增加个体患 AFB1 诱导的 HCC 风险，提示 GSTM1 的缺失型可能和个体的低AFB1 解毒能力有关，并有助于 AFB1-DNA 加合物的形成。而当前研究不仅支持前面所说的假设，而且还发现 AFB1 的暴露与 AFB1-DNA 加合物水平呈正相关(校正 OR 为 1.50,P 0.01)。总之，据我们所知当前研究为第 1 个关于调查GSTM1 基因多态性对 AFB1-DNA 加合物水平影响的研究，该研究显示了关于GSTM1-null 与高水平的 DNA 损伤相关，提示其在个体解毒与 DNA 损伤修复能力在 AFB1-DNA 加合物形成过程的作用。
13、将来应更深入开展 GSTM1-nul 在解毒能 力方面的特异性功能研究，同时调查它们在 DNA 损伤的其它标记因子水平的影响。 【参考文献】1Guengerich FP, Johnson WW, Shimada T, et al. Activation and detoxication of aflatoxin B1 J. Mutation Research,1998,402(1-2):121-128.2Wang JS, Groopman JD. DNA damage by mycotoxins J. Mutation Research,1999,424(1-2):167-181.3Sheeh
14、an D, Meade G, Foley VM, et al. Structure, function and evolution of glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily J. The Biochemical Journal,2001,360(Pt 1):1-16.4Long XD, Ma Y, Wei YP, et al. The polymorphisms of GSTM1, GSTT1,HYL
15、1*2, and XRCC1, and aflatoxin B1-related hepatocellular carcinoma in 5Guangxipopulation, China J. Hepatol Res,2006,36(1):48-55.5McGlynn KA, Rosvold EA, Lustbader ED, et al. Susceptibility to hepatocellular carcinoma is associated with genetic variation in the enzymatic detoxification of aflatoxin B1
16、 J. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1995,92(6):2384-2387.6Blum HE. Hepatocellular carcinoma: susceptibility markers J. IARC Scientific Publications,2001,154:241-244.7Kirk GD, Turner PC, Gong Y, et al. Hepatocellular carcinoma and polymorphisms in carcinogen-metabolizing and DNA repair enzymes in a population with aflatoxin exposure and hepatitis B virus endemic
