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1、1URSA 患者外周血免疫细胞特征及其意义 的临床研究作者：陈慧 陈立斌 宋小侠 谭剑平 孟丽丽 王蕴慧 张睿 刘颖琳 张建平【摘要】 【目的】 探讨不明原因复发性流产(URSA)患者处于难免流产和流产后非孕状态等不同临床情况时外周血免疫细胞特征及其临床意义。 【方法】 回顾性分析 2008-2010 年于我院诊疗的自然流产患者 184 例，就诊时为早期妊娠难免流产的 URSA 患者 55 例(URSA 难免流产组)，同期早期妊娠难免流产的偶发流产患者(sporadic abortion， SA) 23 例，作为对照(SA 难免流产组)。此外，就诊时为未孕状态，距最后一次流产 3 个月以上 U
2、RSA 患者 62 例(URSA 非孕组)，同期未孕状态，距流产 3 个月以上 SA 患者 44 例作为对照(SA 非孕组)。记录患者一般情况，包括年龄、月经周期。使用流式细胞术检测外周血免疫细胞，包括 T 淋巴细胞亚群：T细胞比例、Th 细胞比例、Ts 细胞比例、Th/Ts;其他免疫细胞：白细胞数量、淋巴细胞总数量(LYM 细胞)、B 细胞比例、自然杀伤细胞(NK 细胞)比例。 【结果】 难免流产状态：URSA 患者与 SA 患者 Th/Ts 均异常升高，前者为 2.77 5.16，后者为3.67 6.12，URSA 患者与 SA 患者比较，前者 NK 细胞比例明显升高，为(15.57 6.
3、45)%，后者仅为(11.38 3.66)%，差异有统计学意义(P 0.05)。非孕状态：URSA 患者与 SA 患者比较，URSA 患者 WBC 数量及 NK 细胞比例高于 SA 组，前者为(6.27 1.09) 109、(18.26 7.88)%，后者为(5.59 1.16) 109、(11.0 6.8)%，差异有统计学意义(P 0.05)。 【结论】 在发生早期妊娠难免流产时，URSA 患者与 SA 患者均存在一定的免疫紊乱，共同的表现是特异性免疫方面均有 Th/Ts异常升高，不同的表现是，URSA 患者在非特异性免疫方面存在 NK 细胞比例增2高。在非孕状态，SA 患者免疫紊乱得到调整
4、回复正常，URSA 患者仍然存在一定的免疫紊乱，主要表现在非特异性免疫方面，以 WBC 数量和 NK 细胞比例增高为主。临床工作中应注意监测 URSA 患者的免疫状态。 【关键词】 复发性流产; 妊娠; 免疫耐受; 免疫细胞; 难免流产Abstract： 【Objective】 To investigate the clinical features of peripheral blood immune cells in unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) patients when the patients are in the
5、 state of inevitable abortion or non-pregnancy， and to provide clinical basis for URSA prevention and treatment. 【Methods】 A retrospective analysis of 184 cases of URSA and the spontaneous abortion (SA) patients was conducted， and all patients were divided into 4 groups. URSA inevitable abortion gro
6、up including 55 cases inevitable abortion in early pregnancy， while 23 cases in SA inevitable abortion group. In addition， 62 cases in the URSA non-pregnant group， while 44 cases in the SA non-pregnant group， the visiting time of the URSA non-pregnant group and the SA non-pregnant group were more th
7、an 3 months from last abortion. Records of general situation of all the patients are made including age and menstrual cycle. The peripheral blood immunocytes were tested by using flow cytometry， including T cell ratio， Th cell ratio， Ts cell ratio， Th/Ts， the number of white blood cells (WBC)， the n
8、umber of total lymphocytes (LYM cells)， B cell ratio， and 妊娠时母体免疫系统对胚胎表现出免疫营养和免疫防护而非免疫攻击，一旦这种免疫耐受遭到破坏，可导致病理妊娠的发生1。在各种病理妊娠中，复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion， RSA)是颇为重要的一个，RSA 指连续遭受 2 次或 2 次以上在妊娠 20 周前的妊娠产物或胎儿(体质量 500 g)丢失2。据统计，其发病率在 5%左右3-4。RSA 意味着不断发生的妊娠失败，在生理和心理方面对育龄妇女产生诸多不良影响，故 RSA 的诊疗成为生殖学研
9、究热点。引起 RSA 发病的因素较多，除子宫畸形、内分泌因素和遗传因素及感染致胎儿畸形等，仍有 60% 70%患者病因不明，即原因不明复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion， URSA)，现认为大多数 URSA 与免疫异常有关。本研究旨在观察 URSA 患者在难免流产与非孕时的免疫状态，并与偶发流产患者3(sporadic abortion， SA)进行比较，为 URSA 的防治提供依据。1 材料和方法1.1 分 组1.1.1 URSA 难免流产组2008 年至 2010 年就诊于我院的 URSA 难免流产患者 55 例，本次早期妊
10、娠流产时间为孕 6 10 周，符合以下条件：连续发生 2 次及 2 次以上的早期自然流产;夫妇双方染色体核型正常;盆腔 B 超、宫腔镜排除生殖道器质性病变;宫颈分泌物检查沙眼衣原体、解脉支原体排除生殖道感染;生殖内分泌激素测定无异常，无内分泌疾病史;抗磷脂抗体、抗核抗体等自身免疫抗体阴性;男方精液常规检查正常;就诊时为早期妊娠，有腹痛或阴道流血症状，经检查阴道彩超证实为胚胎停育、难免流产;近 3 个月未使用免疫药物或免疫治疗。1.1.2 SA 难免流产组2008 年至 2010 年就诊于我院，既往无自然流产病史，就诊时难免流产患者 23例，此次就诊时为早期妊娠孕 6 12 周，有腹痛或阴道流血
11、症状，经检查阴道彩超证实胚胎停育、难免流产。既往无内分泌疾病、免疫疾病史。行盆腔 B 超、宫颈分泌物检查沙眼衣原体、解脉支原体、生殖内分泌激素、男方精液常规检查正常。1.1.3 URSA 非孕组2008 年至 2010 年就诊于我院的 URSA 患者 62 例，符合以下条件：连续发生 2 次及 2 次以上的早期自然流产;夫妇双方染色体核型正常;盆腔 B 超、宫4腔镜排除生殖道器质性病变;宫颈分泌物检查沙眼衣原体、解脉支原体排除生殖道感染;生殖内分泌激素测定无异常，无内分泌疾病史;抗磷脂抗体、抗核抗体等自身免疫抗体阴性;男方精液常规检查正常或治疗后恢复正常;封闭抗体阴性;就诊时为非妊娠期，距最后
12、一次流产 3 个月以上。1.1.4 SA 非孕组2008 年至 2010 年就诊于我院的 SA 患者 44 例(既往自然流产 1 次者)5-7。进行生殖保健咨询，无内分泌疾病、免疫疾病史，就诊时为非妊娠期，距流产 3 个月以上。行盆腔 B 超、宫颈分泌物检查沙眼衣原体、解脉支原体、生殖内分泌激素、男方精液常规检查正常。 1.2 临床处理难免流产患者均予以清宫。1.3 标本采集URSA 和 SA 难免流产患者，于清宫前抽取外周血 3 mL，URSA 和 SA 非孕患者，月经第 5 8 天抽取外周血 3 mL，均送流式细胞仪室检测。1.4 检测指标T 淋巴细胞亚群：T 细胞比例、Th 细胞比例、T
13、s 细胞比例、Th/Ts(CD4+ T/CD8+ T)。其他免疫细胞：白细胞数量、淋巴细胞总数量(LYM 细胞)、B 细胞比例、自然杀伤细胞(natural killer cell， NK 细胞)比例。1.5 检测方法5将各组静脉血 3 mL，常规肝素抗凝后使用 Ficoll-Hypaque 法密度离心分离外周血单个核细胞。将细胞悬液使用 CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-EDC/CD3-PC5、CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-EDC/CD3-PC5，通过孵育、透化等处理后，采用BECKMAN COULTER FC 500 流式细胞仪，使用 Cell Quest 软件
14、分选和计算 T 细胞亚群，包括 T 细胞比例、Th 细胞比例、Ts 细胞比例、Th/Ts(CD4+ T/CD8+ T)，以及白细胞数量、LYM 细胞数量、B 细胞比例、NK 细胞比例。1.6 统计学方法使用 SPSS 13.0 软件，计数资料以均数 标准差表示，组间比较采用两独立样本 t 检验或秩和检验。组内比较采取配对资料 t 检验或秩和检验。设 P 0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 一般情况URSA 非孕组月经周期短于 SA 非孕组，P 0.05(表 1、2)。2.2 难免流产状态免疫细胞的比较URSA 患者与 SA 患者 Th/Ts(CD4+ T/CD8+ T)均异常升高，前
15、者为 2.77 5.16，后者为 3.67 6.12(判断标准为 CD4+ T/CD8+ T 1.0 或 2.0)6。URSA 患者与 SA 患者比较，前者 NK 细胞比例明显升高，为(15.57 6.45)%，差异有统计学意义，P 0.05(表 3，图 1、2)。62.3 流产后非孕状态免疫细胞的比较URSA 患者与 SA 患者比较，T 淋巴细胞亚群的各项指标表现为，URSA 组Th/Ts(CD4+ T/CD8+T)高于偶发流产组，前者为 6.72 2.49，后者为 2.16 2.83，差异有统计学意义(P 0.05);其他免疫细胞指标表现为，URSA 患者 WBC 数量及 NK 细胞比例高
16、于 SA 组，前者为(6.27 1.09)%、(18.26 7.88)%，后者为(5.59 1.16)%、(11.00 6.80)%，差异有统计学意义(P 0.05，表 4，图 3、4)。3 讨 论近年，通过 -HCG 检测等方法发现了部分生化妊娠、隐形流产，因此自然流产发生率约 50% 60%。在自然流产患者中，与同一性伴侣只发生过一次自然流产称为偶发性流产(sporadic abortion， SA)，发生率约 11% 13%，其原因多为遗传因素如胚胎染色体或基因异常等。如不进行检查治疗，有 80%的患者能够再次妊娠并成功分娩，其原因在于再次妊娠重复发生遗传因素异常的可能性较小。而复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion， RSA)的发生率因其定义不同而不同，近 20 年，伴随医学诊疗技术的发展以及对患者心理的研究，认为 2 次自然流产即需要予
