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1、1Survivin 特异性 shRNA 表达载体的构建 及评价【摘要】 目的 构建针对人结肠癌细胞系 Lovo 的高效率沉默 Survivin 的 shRNA表达载体。方法 合成特异性干扰 Survivin 的小发卡 RNA（shRNA）片段，并与pGenesil2 载体连接，构建 Survivin 干扰载体（pGenesil2Survivin shRNA）。利用脂质体将其转染 Lovo 细胞，分为正常细胞对照组和 3 个 shRNA 干扰组（pGenesil2Survivin1、2 及 3），应用荧光显微镜对转染效果进行评价，应用Western 印迹和免疫细胞化学法分析转染后 Lovo 中
2、Survivin 的蛋白表达水平。结果 插入片段测序结果与合成 shRNA 结果一致；转染效率可达 70%左右，转染pGenesil2Survivin shRNA 后，3 个干扰组的 Lovo 细胞中 Survivin 蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P0.01）。结论 成功构建了能高效沉默 Survivin 的RNAi 表达载体；且 pGenesil2Survivin 高效抑制结肠癌 Lovo 细胞中 Survivin 基因表达。 【关键词】 RNA 干扰；生存素；结肠癌；shRNA研究显示，Survivin 在人结肠癌组织以及细胞系中存在高表达，并与人结肠癌的形成和演进存在密切关系，其
3、作用机制可能涉及促进结肠癌恶性增殖及抗细胞凋亡等多个方面1，2。因此，靶向 Survivin 的研究对明确结肠癌的发病及转移机制以及提高结肠癌的疗效均有重要意义35。故本研究利用 pGenesil2 真核表达载体构建了含高效的靶向 Survivin 基因的重组载体 pGenesil2Survivin shRNA，并进一步应用其沉默人结肠癌系 Lovo 的 Survivin 基因，为探讨 Survivin 在结肠癌发生、发展中的作用及应用其进行结肠癌的基因治疗奠定实验室基础。21 材料与方法1.1 材料 感受态细胞 DH5 为我室保存。干扰载体 pGenesil1 和 pGenesil2 购自晶
4、赛公司（pGenesil1 载体为带有荧光蛋白 EGFP 基因的 pGenesil2 序列）。质粒DNA 纯化试剂盒及质粒小提试剂盒购自 Qiagen 公司（荷兰）。所用的酶BamH、Hind、T4 DNA 连接酶、Sal和 Pst均购自 Takara 公司（日本）。1.2 Survivin shRNA 表达载体构建及鉴定 由 Genbank 查到 Survivin 的 cDNA序列，根据 Ambion 公司在线设计软件，筛选 3 个长度均为 19 bp 的靶定序列，分别为：模板 1、2 和 3 分别为正义 5GGACCACCGCATCTCTACA3，反义5TGTAGAGATGCGGTGGTC
5、C3；正义 5GCATTCGTCCGGTTGCGCT3，反义5AGCGCAACCGGACGAATGC3；正义 5GGCTGGCTTCATCCACTGC3；反义5GCAGTGGATGAAGCCAGCC3的靶基因序列。设计 3 对寡核苷酸序列设计引物。引物结构：在设计的寡核苷酸链中，其两端分别为 BamH和 Hind的酶切位点，能与线性化载体直接相连，中间的 9 个碱基为形成发卡结构的环区，以上序列由上海生工公司合成。线性化 pGgenesil2 质粒：载体 pGenesil2 经BamH和 Hind双酶切，1琼脂糖凝胶回收大片段。发卡 shRNA 寡核苷酸链的退火：用 50 l 退火缓冲液分别溶
6、解上述合成的寡核苷酸片段。各取 2 l（即2 l 正义链+2 l 反义链）+16 l 退火缓冲液混匀。94水浴退火自然冷却至室温。取 1 l 退火产物+99 l H2O 做 100 倍稀释。重组载体 pGenesil2Survivin shRNA 的构建：T4 DNA 连接酶连接退火寡核苷酸链与线性化载体 pGenesil2，建立 10 l 连接反应体系：取稀释退火寡核苷酸链 1 l，线性化 pGenesil2 质粒载体 1 l，10连接酶缓冲液 1 l，T4 DNA 连接酶 1 l，H2O 6 l，22水浴反应过夜。3细菌转化与质粒提取：取 5 l 过夜连接产物转化感受态细胞 DH5，涂布于
7、含Kana 抗性（终浓度为 30 mg/L）的 LB 平板上，37恒温箱培养过夜。从培养皿上挑取 3 个单克隆菌落接种于 3 ml 含 Kana 抗性（终浓度为 30 mg/L）的 LB 培养液中，37恒温摇床（250 r/min）培养过夜。用小提试剂盒小量提取质粒。重组载体的酶切鉴定：质粒分别用 Pst和 Sal做酶切鉴定，反应条件为：质粒 DNA 8 l，10缓冲液 1 l，Pst和 Sal酶各 1 l；37水浴反应 3 h，1%琼脂糖凝胶电泳；送北京英俊公司测序。1.3 pGenesilSurvivin shRNA 质粒转染人结肠癌 Lovo 细胞转染效率的测定 将Lovo 细胞铺于覆有
8、盖玻片的 6 孔板内，接种密度约为 5105 个/孔。24 h 后换液，用脂质体 Lipo 2000 转染含有荧光发光基因 EGFP 的 pGenesil1 载体及pGenesil2Survivin shRNA 质粒，转染前 12 h 换为无双抗的 DMEM 培养基，然后用无血清无双抗的 DMEM 培养基转染。转染 6 h 后换为含有 10%胎牛血清的DMEM 培养基，转染后 48 h 盖玻片用荧光显微镜分别观察转染情况。1.4 pGenesil2Survivin shRNA 质粒转染人结肠癌 Lovo 细胞干扰效果的测定 实验分为 4 组，分别为正常细胞对照组、pGenesil2Surviv
9、in shRNA1、2 以及 3 组，每组设 4 复孔。Western 印迹检测：收集细胞，用 0.01 mmol/L PBS 缓冲液漂洗 3次后加入 200 l 细胞裂解液混匀、冰浴 30 min。15 000 r/min 离心 10 min 后，以Lowry 法行总蛋白定量分析。制备 12分离胶、5积层胶。按计算好的样品量上样，使各组上样量相等，在 8 V/era 电压条件下行 SDS 聚丙烯酰胺电泳，待溴酚蓝进入分离胶时，将电压提高到 15 V/era。电泳结束后，将 SDS 分离出的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上（Millipore,USA）。以含 5脱脂奶粉的 TBS 溶液封闭 2 4h
10、，PTTG 鼠抗人单克隆一抗和 actin 室温孵育 2 h，相应的二抗室温孵育 1.5 h，ECL 试剂盒显色，拍照。2 结 果2.1 重组载体测序结果 pGenesil2Survivin1、2 和 3 的测序结果显示，设计的 3对 shRNA 片段均已成功地连入 pGenesil2 载体中，即重组载体pGenesil2Survivin shRNA 均构建成功。2.2 pGenesil2Survivin shRNA 载体转染 Lovo 细胞转染效率的测定 应用与载体 pGenesil2 具有基本具有相同序列的 pGenesil1 载体（pGenesil1 中比 pGenesil2只多出 EG
11、FP 蛋白的序列）测定转染效率。转染 48 h 后测定 Lovo 细胞转染效率结果显示，正常细胞对照组荧光表达百分率约为 8%，转染组荧光表达百分率为70%（图 1）。即 Lovo 细胞的转染效率约为 62%，已经可以满足实验需要。图 1 荧光显微镜下观察 Lovo 细胞转染2.3 pGenesil Survivin shRNA 质粒转染 Lovo 细胞干扰的检测 通过 Western 印迹测定干扰后 Lovo 细胞中 Survivin 蛋白表达情况，pGenesil Survivin shRNA1、2 和3 转染 Lovo 细胞中 Survivin 蛋白表达干扰效率分别为 78%、65.2%
12、和 69.3%（图2）。图 2 转染 pGenesil Survivin shRNA 质粒后Lovo 细胞 Survivin 表达情况 3 讨 论RNAi 介导的特异性同源基因 mRNA 降解的一种细胞反应过程，是转录后基因5沉默(pTGs)的一种形式。RNAi 首先由 Fier 等人于 1998 年发现并命名6。目前已发现 RNAi 具有多方面的显著特点79：高特异性，siRNA 引起同源基因mRNA 的降解具有高度的特异性，因为即使一个碱基的改变往往就会大大降低甚至完全丧失 siRNA 对靶基因的抑制作用；高效性，RNAi 过程一旦被启动，反应信号就可以被一定程度地扩增和放大，最低每个细胞
13、内一份拷贝的 siRNA 就足以达到基因抑制的效果；高稳定性，通过采用 RNAi 对线虫全基因组功能进行分析的结果显示，其中 50%80%的序列选择有效，12.9%27%的基因抑制产生了明显的异常表型，因此 RNAi 作用具有很高的成功率和稳定性。此外，RNAi 还具有研究周期短、操作简单等突出优点。由于 RNAi 所具有的上述重要特点，使得它在发现后迅速地发展并展示了其在生命科学研究中有极其广阔的应用前景。RNAi 的主要应用方向包括8，10，11：研究基因功能，在后基因组时代规模性的基因功能研究中，通过 RNAi 特异性抑制基因的表达可获得特定蛋白功能丧失或降低的突变体，从而借以阐明特定基
14、因在生物体中的功能。疾病基因治疗，由于 RNAI 可以特异性和高效性地抑制基因的表达，毋庸置疑，它将在遗传病、病毒感染和癌症等人类多种顽固性疾病的基因治疗中发挥重要的作用。新药物研究和开发，RNAi 可用作寻找新的药物靶标的有效工具，可高通量地对发现的药物靶基因做功能分析，还可以帮助了解药物作用的生化模式等等。正是由于 RNAi在生命科学研究中所具有的重大意义，因此将 RNAi 技术应用到结肠癌的基因治疗中，在治疗策略上或进行多基因联合治疗，或传统治疗与基因治疗联合应用，恶性结肠癌的基因治疗有望产生突破性进展。本实验表明所构建的 pGenesil2 质粒载体可有效沉默 Lovo 细胞中的 Su
15、rvivin 基因表达。数据对比分析可以发现，所合成的 3 组干扰质粒载体中，Survivin 6shRNA1 组干扰效率最高，对 Lovo 细胞中 Survivin 蛋白的沉默效率可以达到 70%以上，可作为下一步分析研究的优选载体。【参考文献】1 Okon K,Demczuk S,Klimkowska A,et al.Correlation of microsatellite status,proliferation,apoptotic and selected immunohistochemical markers in colorectal carcinoma studied with
16、 tissue microarrayJ.Pol J Pathol,2006;57(2):10511.2 Abd ElHameed A.Survivin expression in colorectal adenocarcinoma using tissue microarrayJ.J Egypt Natl Canc Inst,2005;17(1):4250.3 Tan HY,Liu J,Wu SM,et al.Expression of a novel apoptosis inhibitorsurvivin in colorectal carcinomaJ.World J Gastroenterol,2005;11(30):468992.4 Li B,Fan J,Liu X,et al.Suppression of colorectal tumor growt
