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1、1SU11248 干预白血病细胞 HL60 对 P27KIP1 和 cyclin G 蛋白表达的影响作者：林东红, 韩燕燕, 陈惠瑜, 罗玲清, 胡建达【摘要】 目的: 探讨 SU11248 对人髓系白血病细胞株 HL 60 的效应及其对HL 60 细胞表达 P27KIP1 和 cyclin G 蛋白改变的影响。方法: 应用 MTT 法检测SU11248 对 HL 60 细胞增殖能力的影响; 采用 Western blot 检测 SU11248 干预HL 60 细胞前后 P27KIP1 和 cyclinG 蛋白表达水平的变化及其相关性。结果: 不同浓度（0.5、 1.0、 2.0、 4.0、
2、8.0 mg/L）SU11248 作用 HL 60 细胞 24 h、 48 h、 72 h、 96 h 后, SU11248 可抑制 HL 60 细胞增殖, 抑制作用呈现剂量和时间依赖性, 半数抑制浓度（IC50）约为 2.0 mg/L。2.0 mg/L SU11248 作用 HL 60 细胞 72 h 时抑制率达到最高。2.0 mg/L SU11248 作用 HL 60 细胞后 cyclinG 蛋白表达呈时间依赖性降低, 而 P27KIP1 蛋白表达呈时间依赖性升高。两蛋白各时间组的改变与对照组相比差异均有统计学意义（P0.05）。结论: SU11248 具有抑制HL 60 细胞增殖的生物效
3、应, 在 HL 60 细胞及 SU11248 干预 HL 60 细胞过程中, P27KIP1 基因可能对 cyclinG 基因及细胞周期发挥负性调控作用。SU11248通过上 P27KIP1、 下调 cyclin G 而干扰细胞周期可能是其发挥抑制肿瘤细胞分裂的环节之一。 【关键词】 SU11248; HL 60 细胞; P27KIP1; cyclinG造血细胞周期调控异常是白血病发生过程中最重要的事件之一。参与细胞周期调控的因子主要有细胞周期蛋白（cyclins）、 细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinases, CDK）、 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cy
4、clin dependent kinases inhibitor, CKI）。在多种 cyclin 中, cyclinG 在细胞周期家族中发现较晚, 其功能可能为在细胞周期调控和 DNA 修复中起作用, 并参与细胞凋亡过程。有资料报道1, 在某些肿瘤中, cyclinG 的过表达有促进细胞周期的作用, 可促进细胞增殖及癌细胞生长过程, 在肿瘤的生物靶向治疗方面有很好的应用前景。有研究初步发现 cyclin G 与急性淋巴细胞白血病、 慢性粒细胞白血病等恶性血液病有关2。CKI 的 Kip 家族包括 p21、 p27、 p57。其中 P27KIP1 为新近发现的广谱的 CKI, 能抑制大多数 c
5、yclin CDK 的磷酸化激酶活性, 是细胞转录的负性调控因素, 在实验性肿瘤的发生发展过程中被证实是一种抑制癌基因3。其低表达或不表达与白血病患者病情进展及预后相关4。在白血病的研究中, 发现某些 cyclin 的表达与 CKI 的表达之间存在着正反馈机制5, P27KIP1 为广谱的 CKI, 其与 cyclin G 之间也可能存在互调控关系。苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate, Sutent, SU 11248)是一种新的多靶点酪氨酸激酶抑制剂, 具有抗肿瘤和抗血管生成的双重作用。2006 年 1 月 FDA 批准本品用于甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate
6、, GGleevec)治疗失败或不能耐受的胃肠道间质瘤患者以及晚期肾细胞癌患者6, 7, 对其他实体瘤的治疗应用也已进入 II 期临床阶段, 但其与恶性血液病关系的研究尚不多。因此, 我们拟以人髓系白血病细胞株 HL 60 为白血病模型, 探讨白血病细胞 HL 60 P27KIP1 与 cyclin G 蛋白的表达及 SU11248 干预对蛋白表达的影响, 为白血病的生物靶向治疗提供新途径。1 材料和方法31.1 材料 SU11248 购自 biocompound 公司。用二甲亚砜溶解, -20避光保存备用。人髓系白血病细胞株 HL 60 由福建省血液病研究所传代保存。RPMI1640 培养液
7、为 Gibco 公司产品; 二甲亚砜、 MTT 溶液为 Sigma 公司产品; Protein Extraction Reagent 为 Pierce 公司产品; P27KIP1 多克隆抗体（兔抗人）为eBioscience 公司产品; cyclin G1 多克隆抗体（兔抗人）为 LAB VISION 公司产品; actin 单克隆抗体（大鼠抗人）、 Western blot Luminol Reagent 为 Santa Cruz 公司产品; actin 蛋白、 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 及山羊抗大鼠 IgG、 硝酸纤维膜(NC 膜)购于北京中山生物技术公司。1.2 方法1.2.1
8、 建立细胞培养体系 HL 60 细胞用含 100 mL/L 胎牛血清的 RPMI1640 培养液, 于 37、 50 mL/L CO2, 饱和湿度条件下培养, 2 d 传代 1 次, 培养中的细胞密度均保持在(1.05.0)108/L, 取对数生长期细胞作为实验用细胞。1.2.2 MTT 法检测 SU11248 对 HL 60 细胞的干预作用 取对数生长期细胞, 将密度调整为 1.0108/L, 分别与终浓度为 0.5、 1.0、 2.0、 4.0、 8.0 mg/L 的SU11248 共培养, 以未处理的 HL 60 细胞为对照, 分别接种于 96 孔板, 每孔200 L, 每组设 4 个平
9、行孔, 置 37、 50 mL/L CO2 饱和湿度条件下进行细胞培养, 分别于 24 h、 48 h、 72 h、 96 h 加入 5 g/L 的 MTT 溶液 20 L/孔, 继续培养4 h 后离心去上清, 加入终止液 DMSO 溶液 150 L/孔, 振荡 10 min, 在酶标仪上用双波长 492 nm 和 630 nm 测吸光值（A 值）, 以吸光值为纵轴, 作用时间为横轴绘制细胞增殖曲线。取 48 h 的 A 值比较各组的细胞增殖抑制率, 细胞增殖抑制率=（1-用药组平均 A 值）/对照组平均 A 值100%, 实验重复 3 次, 取均值。计算4IC50(半数抑制浓度)。1.2.3
10、 Western blot 检测 P27KIP1 和 cyclinG 蛋白水平的变化 以 IC50（2.0 mg/L）的 SU11248 作用 HL 60 细胞后, 于 24 h、 48 h、 72 h 分别提取蛋白, 以 actin蛋白为内参, 进行 Western blot 检测, 简述如下: 收集对照组和 2.0 mg/L 的SU11248 作用 24 h、 48 h、 72 h 后的 HL 60 细胞, 每组约 5109/L 个, 用预冷PBS 洗 2 次, 去上清。按 1106 细胞/100 L 裂解液+1 U 蛋白酶抑制剂的比例裂解细胞, 提取细胞总蛋白。Bradford 法测定蛋
11、白浓度, 20 g 总蛋白进行 120 g/L SDS 聚丙烯酰胺凝胶(SDS PAGE)电泳, 电转移至 NC 膜上, 用 50 g/L 脱脂奶粉封闭 1 h。根据蛋白 Marker, 将膜在适当的位置剪开, 做好标记, 分别与相应的一抗(1100 兔抗人 P27KIP1 抗体、 1200 兔抗人 cyclin G1 抗体、 11 000 鼠抗人 actin 抗体)反应过夜。再与相应二抗(12 000 山羊抗兔 IgG 及 15 000 山羊抗大鼠 IgG)室温下反应 1 h, ECL 免疫印迹化学发光试剂放射自显影, 应用计算机图像扫描分析系统对图像进行扫描分析, 以目的条带与内参照 ac
12、tin 的灰度值之比作为目的条带蛋白的相对表达量。实验重复 4 次。1.2.4 统计学分析 采用 SPSS11.0 统计软件对所有数据进行统计学分析, 多组间均数比较采用方差分析, 均数间两两比较用 Dunnett t 检验, 组间率的比较采用2 检验, 实验结果用 xs 表示, 以 P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果2.1 MTT 法检测 SU11248 对 HL 60 细胞增殖的影响2.1.1 不同浓度 SU11248 对 HL 60 细胞的增殖抑制作用 MTT 实验显示, 不同浓度 SU11248 作用 HL 60 细胞 24 h、 48 h、 72 h、 96 h 后, 细胞增
13、殖反应均较对照组减低（表 1）, 生长曲线渐趋平缓。SU11248 对 HL 60 细胞的抑制率随药物5浓度的加大而增加, 各浓度组与对照组相比差异有统计学意义（P0.05), 并且随作用的时间延长而增加。SU11248 作用 HL 60 细胞 48 h 后, SU11248 为 0.5、 1.0、 2.0、 4.0、 8.0 mg/L 处理组对 HL 60 细胞生长的抑制率分别为 24.0%、 33.0%、 41.8%、 72.2%、 92.5%。根据正规机率单位法计算得 IC50(半数抑制浓度)约为 2.0 mg/L。表 1 SU11248 对 HL 60 细胞生长的影响2.1.2 SU1
14、1248 对 HL 60 细胞增殖抑制作用的时效关系 2.0 mg/L 的 SU11248作用 HL 60 细胞 24 h、 48 h、 72 h、 96 h 后, 各时间段的 HL 60 细胞均受不同程度的抑制, 在 72 h 时抑制率达到最高, 结果见表 2。表 2 SU11248（2.0 mg/L）作用 HL 60 细胞不同时间后的抑制率2.2 Western blot 检测 SU11248 干预 HL 60 细胞前后 P27KIP1 和 cyclinG 蛋白表达水平的变化 2.0 mg/L SU11248 作用 HL 60 细胞 24 h、 48 h、 72 h 后, 与对照组相比,
15、cyclinG 蛋白表达水平明显降低, 且随着处理时间的延长表达水平逐渐降低(P0.05); 而 P27KIP1 蛋白的表达水平升高, 且随着处理时间的延长, 表达水平逐渐增高(P0.05, 图 1、 表 3)。表 3 各时间组 HL 60 细胞 P27KIP1 和cyclinG 蛋白表达分析（n=4, xs）3 讨论继续深入研究细胞毒性药物, 逐渐开发和引入分子靶向性药物, 是 21 世纪后抗肿瘤药物研发的重要战略。从细胞受体与增殖调控的分子水平研究肿瘤发生机制、以相应分子为靶点的药物研发和临床治疗成为目前研究的热点。SU11248 是一种口服的小分子药物, 能够抑制 VEGF R2、 R3
16、 和 R1 以及 PDGFR 、 KIT、 FLT 3 和 RET 的酪氨酸激酶活性, 通过特异性阻断这些信号6传导途径达到抗肿瘤效应。因其抗肿瘤活性在各种晚期恶性肿瘤治疗中得到证实而倍受关注。国外有实验初步表明 SU11248 可以诱导急性髓细胞白血病患者部分缓解8。为探讨 SU11248 对白血病细胞的可能作用, 探讨 SU11248 干预前后人髓系白血病细胞株 HL 60 细胞 P27 KIP1 和 cyclin G 蛋白表达及其相关性, 为 SU11248 在白血病的治疗研究及分子靶向治疗提供实验依据, 本实验观察不同剂量 SU11248作用 HL 60 细胞不同时间后对细胞增殖的影响, 并检测 cyclin G 及其负调控因子 P27KIP1 蛋白表达的变化。结果显示: SU11248 对 HL 60 细胞增殖具有较强的抑制作用, 此抑制作用具有明显的量效和时效关系。SU11248 作用 HL 60 的IC50 约为 2.0 mg/L。SU11248 抑制 HL 60 细胞增殖过
