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1、1TFF3 在大鼠实验性胃溃疡胃黏膜不同部 位的表达作者：吕洋 吴靖芳 刘博 王志勇 王浩宇 郑慧娥 张耕 张江兰【摘要】 目的：探讨大鼠实验性胃溃疡期间，三叶肽因子 3(trefoil factor3，TFF3)免疫反应细胞在胃黏膜不同部位中表达的变化。方法：通过胃前壁黏膜下注射冰乙酸制备大鼠胃溃疡模型，应用免疫组织化学 S P 法检测 36 只大鼠不同部位胃黏膜组织中 TFF3 的表达。结果：(1)胃溃疡损伤后大鼠胃黏膜 TFF3 的阳性表达率为 63.9%(23/36)。(2)溃疡周边部位 TFF3 的数密度要显著高于远离溃疡的其它部位(P0.01)。其中，溃疡周边部位 TFF3 的数密
2、度从大鼠胃溃疡损伤后的第 2 天开始到损伤后的第 6 天呈递增趋势，且显著高于对应时期的远离溃疡的其它部位(P0.01);而损伤后的第 1 天以及第 10 天以后，溃疡周边部位 TFF3 的数密度与远离溃疡的其它部位差异没有显著性意义(P0.05)。结论：大鼠胃溃疡期间TFF3 表达增高，溃疡周边部位 TFF3 的表达更强，TFF3 对溃疡损伤起着保护及修复作用。 【关键词】 胃溃疡;三叶肽因子 3;免疫组织化学;大鼠【ABSTRACT】 Objective:To explore the changes of TFF3 immunoreactive cells in different pos
3、ition of gastric mucosa during experimental gastric ulcer.Methods:Acetic acid induced ulcers were caused by injection acetic acid to subserosal of paries anterior gastricus.The expressions of TFF3 in 36 rats were detected by immunohistochemical S P method with anti TFF3.Results:(1)In gastric ulcer,T
4、FF3 expression rate was 63.9% of cases.(2)The numerical densities on area(NA)around the ulceration were stronger than that far away from it(P0.01),especially among the second day to the sixth day after the experimental gastric ulcer in rats(P0.01).But in the first day and after tenth day of gastric
5、ulcer,the two groups had no statistical significance(P0.05).Conclusion:The expression of TFF3 during gastric ulcer is 2high.TFF3 expression is stronger around the ulceration than that far away from it.TFF3 can protect and respair the mucosa of gastric ulcer.【KEY WORDS】 Stomach ulcer,Trefoil factor 3
6、,Immunohistochemistry,Rats三叶因子家族(trefoil factor family,TFF)是一群主要由胃肠道粘液细胞分泌的小分子多肽。目前在哺乳动物体内发现的三叶肽(trefoil peptide)有 3 种，即乳癌相关肽(pS2 或 TFF1)、解痉多肽(SP 或 TFF2)和肠三叶因子(ITF 或 TFF3)1。其中TFF3 是在 1991 年由 Suemori 等2从大鼠空肠中发现的，分子仅由 59 个氨基酸组成，含有 1 个 P 结构域。正常情况下，TFF 的主要表达位点是在胃肠道，且有区域性和细胞选择性。TFF1 在正常组织中主要由胃窦和胃体的隐窝及表层上
7、皮的黏膜细胞产生;TFF2 主要分布于远端胃和下段十二指肠腺;TFF3 主要分布于肠黏膜。当胃肠黏膜受损时，三者表达的组织专一性消失3。国外学者报道实验性胃溃疡期间胃黏膜出现 TFF3 高表达4。但胃溃疡形成及愈合过程胃黏膜不同部位TFF3 的报道少见。我们通过大鼠乙酸溃疡模型，检测大鼠实验性胃溃疡形成及自愈过程不同部位 TFF3 的改变。1 材料与方法1.1 大鼠实验性胃溃疡模型的制作雄性 8 周龄 SD 大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)共 36 只，体质量 180230g。用 3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉。胸腹部剃毛，消毒，在无菌条件下(手术切口长约 2cm)暴露胃
8、。在胃前壁近胃窦处将 0.01mL 冰醋酸注入胃黏膜下层。注射后，胃壁表面立即形成一个圆形或椭圆形的隆起，然后该处变为一乳白色不透明区，直径约 5mm。将大网膜覆盖于注射区后，逐层缝合腹壁切口。31.2 取材方法取材前禁食 12h，不限饮水。动物用 3%戊巴比妥钠麻醉后，迅速开胸，主动脉插管，剪开右心耳，首先灌注生理盐水 100mL，继之灌注 4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)250mL，维持 20min。在手术后 1、2、4、6、10 和 14d 分批取胃前壁近胃窦处(每个时间点 6 只)，沿胃大弯剪开大鼠胃壁，PBS 液冲洗干净后平铺，将溃疡边缘勾画在玻璃纸上，以便用每小方格 1mm1m
9、m 的坐标纸估算溃疡面积。剪取溃疡旁约 3mm5mm 的组织条，置于 Bouin s 液中，石蜡包埋，连续切片，厚 6m，裱贴于涂有 APES 的载片，行免疫组化染色。1.3 免疫组化染色采用免疫组织化学 S P 法，DAB 染色。兔抗人 TFF3 多克隆抗体(工作浓度为1100)，S P 试剂盒，枸橼酸抗原修复缓冲液、DAB 染色剂分别购自武汉博士德生物工程公司及福州迈新生物技术开发公司。切片染色前根据抗体要求行枸橼酸缓冲液高温高压抗原修复。余具体操作过程按试剂盒说明书完成，并设立阳性对照(公司提供)和阴性对照(以 PBS 缓冲液代替一抗)，在光镜下观察阳性反应呈棕黄色。1.4 观察用 OL
10、YMPUS CX31 显微镜连接 MiE 显微图像处理软件在计算机上进行观察：TFF3 的判断标准：以胞浆内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞，每只动物随机选择 10 个高倍视野，计数总细胞数以及阳性细胞数，并计算阳性细胞率。以10%阳性细胞为阳性，10%为阴性;用成像系统在显微镜下随机圈定面4积，在高倍镜下计数所选区域阳性细胞数，通过计算阳性细胞的数密度对不同部位胃黏膜进行统计分析;阳性细胞数密度(The numerical densities on area，NA)= TFF3 阳性细胞数目/所选胃黏膜面积。1.5 统计学处理以上所得数据均采用 SPSS14.0 统计软件进行分析。计量资料用(xs
11、)表示。胃溃疡不同部位的数密度比较用 ANOVA 方差分析。以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 制模后的溃疡面观察制模术后 1d，溃疡组大鼠胃体前壁即可见一个直径 36mm 的溃疡，溃疡呈圆形或椭圆形，中心颜色苍白，边界清楚，周围黏膜充血水肿。术后 2d 溃疡最为明显，溃疡中心可见灰白色苔膜。术后 4d 溃疡周围边界清晰，黏膜不再充血水肿，呈典型的龛形溃疡，90%以上为穿孔性溃疡，周围大网膜和肝脏粘连包裹形成溃疡底。随后进入愈合阶段，溃疡面积逐渐减小。至 14d 左右溃疡直径在 12mm，有的已经接近完全愈合。光镜下观察，术后 2d 坏死黏膜脱落形成明显溃疡，黏膜腺体消失，炎性
12、细胞浸润;4d 可见上皮细胞向溃疡中心移行;6d 溃疡边缘可见新形成的扩张腺体;14d 后溃疡处胃壁结构逐渐完成再生，有的黏膜及黏膜下层近似正常。2.2 胃黏膜 TFF3 的染色情况TFF3 染色主要在胞浆(见图 1图 2)，胃溃疡损伤后大鼠胃黏膜 TFF3 的总体5阳性表达率为 63.9%(23/36)。2.3 距溃疡不同部位胃黏膜 TFF3 表达的数密度比较我们的实验结果显示，溃疡周边部位及远离溃疡部位大鼠的胃黏膜不仅在例数上表达 TFF3 差异有显著性，而且在数密度上差异也有统计学意义(P0.01)(见表 1，图 34)。其中，溃疡周边部位 TFF3 的数密度从大鼠胃溃疡损伤后的第2 天
13、开始到损伤后的第 6 天呈递增趋势，且显著高于对应时期的远离溃疡的其它部位(P0.01);而损伤后的第 1 天以及第 10 天以后，溃疡周边部位 TFF3 的数密度与远离溃疡的其它部位差异没有显著性意义(P0.05)。表 1 溃疡自愈期间不同部位 TFF3 阳性细胞数密度变化注：与对照组(远离溃疡组)相比*P0.01 2.4距溃疡不同部位胃黏膜 TFF3 随损伤时间的改变通过统计分析我们发现，溃疡周边细胞 TFF3 的改变与损伤后发生的时间呈负相关(P0.05,r=-0.333);而远离溃疡部位细胞 TFF3 的改变与损伤后的时间不具有相关性(见表 2，图 5)。表 2 距溃疡不同部位 TFF
14、3 的改变与损伤时间的关系注：与对照组(远离溃疡组)相比*P0.053 讨论TFF3 是最近发现的三叶肽家族成员之一，目前的研究认为，TFF3 主要在小肠及结肠杯状细胞中表达，在人子宫、正常乳腺、下丘脑、垂体、肺等组织中的低水平表达亦有报道。对于 TFF3 在胃黏膜的表达情况，目前公认的是在人胃黏膜不表达 TFF3，但在胃溃疡及胃癌中都有其高表达的报道5。关于 TFF3 在距溃疡不同部位表达情况的差异，早在 1990 年 Wright 等6发现6在慢性溃疡附近区域存在一个特有的解剖结构即溃疡相关细胞系(UACL)。在消化性溃疡以及溃疡性结肠炎时会出现 UACL。UACL 是一种腺样结构，直接来
15、源于肠腺隐窝基部干细胞群。UACL 可以不断地产生新的细胞并迁移到溃疡表面，促进溃疡修复。UACL 表达已知的三种 TFF 以及 EGF、TGF。这些因子出现的先后顺序存在一定争议，早期研究发现 UACL 首先表达 EGF 和 TGF，再刺激邻近的细胞表达 TFF。近期实验性胃溃疡模型研究表明，首先在黏膜损伤 30min 至 2h TTF2 mRNA 表达达到高峰，12h 后降至正常水平;接着第 2 天再表达 TTF3 mRNA，第 3 天达高峰，随后逐渐下降，损伤后 10d 降至近正常水平，最后为 EGF和 TGF4。因此推断，与 EGF 和 TGF 相比，TFF 的表达可能是对损伤的早期快
16、速反应。我们的研究结果表明，溃疡周边部为 TFF3 的表达要显著强于远离溃疡的其它部位(P0.01)，与上述的研究结果相符。同时，从大鼠胃溃疡损伤后的第 2 天开始到损伤后的第 6 天，溃疡周边部位 TFF3 的表达均显著强于远离溃疡的其它部位(P0.01);而损伤后的第 1 天以及 10d 之后，胃体各部位 TFF3 的表达差异没有显著性意义(P0.05)。这一结果不仅印证了 TFF3 并不是开始就存在于正常胃黏膜当中，而是当出现了溃疡损伤后伴随着损伤黏膜的修复其开始表达并逐渐增多的，而且在溃疡周边部位 TFF3 表达更强一些，同样印证了其参与修复受损黏膜的作用。而随着损伤黏膜的逐渐恢复，TFF3 的表达含量又逐渐降低，且在距溃疡的各个部位其表达含量没有显著性差异，也与上述推论相一致。有研究结果证明，三叶肽可增强受损黏膜周围完好的上皮细胞向损伤黏膜表面迁移覆盖，促进损伤黏膜的重建8。通过统计分析我们发现，溃疡周边细胞TFF3 的改变与损伤后发生的时间呈负相关(P0.05,r=-0.333);而远离
