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1、1OAS-1 基因 SNP rs2660 与慢性 HBV 感染 者自发性 HBeAg 血清转换的关系作者：陈禄彪， 揭育胜， 许 镇， 徐启桓， 彭晓谋， 高志良【摘要】 【目的】 探讨寡聚腺苷酸合成酶基因-1(OAS-1)位点 rs2660 的单核苷酸多态性(SNP)与慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者自发性 HBeAg 血清转换的关系。 【方法】 收集 126 例慢性 HBV 感染者(HBeAg 阳性组 58 例，HBeAb 阳性组 68 例)和无 HBV 感染者(对照组 72 例)的外周血，进行 DNA 提取和扩增，再利用竞争分化聚合酶链反应(CD-PCR)进行扩增，并结合酶免疫法显色以检
2、测该 SNP 的基因型，两组间基因型比例或等位基因频率采用?字 2 检验和优势比(OR)计算。 【结果】 在HBeAg 阳性组 SNP rs2660 基因型 GG + GA 比例为 29.3%(17/58)、等位基因 G 频率为 16.4%(19/116)，而在 HBeAb 阳性组分别为 47.1%(32/68)和 28.7%(39/136)，对照组分别为 52.7%(38/72)和 30.6%(44/144);HBeAg 阳性组与 HBeAb 阳性组或对照组之间的差异均存在统计学意义(基因型：P = 0.042 和 0.007;等位基因：P = 0.021 和 0.008)，而 HBeAb
3、阳性组与对照组之间的差异无统计学意义(基因型：P = 0.499;等位基因：P = 0.731)。 【结论】 SNP rs2660 等位基因 G 可能有助于慢性 HBV感染者发生自发性 HBeAg 血清转换，其基因型检测对于干扰素治疗慢性 HBV 感染者可能有一定的疗效预测价值。 【关键词】 寡聚腺苷酸合成酶; 单核苷酸多态性; 乙型肝炎病毒; 等位基因; 基因型Abstract： 【Objective】 The aim of this study was to investigate the relationship between the single nucleotide polymor
4、phism (SNP) rs2660 of oligoadenylate synthetase gene-1 (OAS-1) and spontaneous HBeAg seroconversion on patients with 2chronic hepatitis B virus (HBV) infection. 【Methods】 Blood samples were collected from 128 patients with chronic HBV infection (58 HBeAg positive， 68 HBeAb positive)， and 72 normal c
5、ontrol cases without HBV infection. Chromosomal DNA was extracted and OAS-1 gene was amplified. SNP genotyping was performed with the enzyme immunoassay (EIA) after the competitively differentiated polymerase chain reaction (CD-PCR). Odds ratio and chi-square test were applied in statistical analysi
6、s. 【Results】 In HBeAg positive group， frequencies of genotype GG plus GA and allele G were 29.3% (17/58) and 16.4% (19/116) on SNP rs2660， respectively. They were 47.1% (32/68) and 28.7% (39/136) in HBeAb positive group， 52.7% (38/72) and 30.6% (44/144) in normal control group， respectively. Differe
7、nces between HBeAg positive group and HBeAb positive group or normal control group were statistically significant (genotype： P = 0.042 and 0.007; allele： P = 0.021 and 0.008). But they weren?蒺 t between HBeAb positive group and normal control group (genotype： P = 0.499; allele： P = 0.731). 【Conclusi
8、on】 Allele G on SNP rs2660 of OAS-1 gene maybe benefit patients with chronic HBV infection to achieve spontaneous HBeAg seroconversion. Genotyping on this SNP may be predicting valuable for interferon therapy for chronic HBV infection.人寡聚腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase， OAS)是一类由干扰素(interferon， IFN)
9、诱导产生的酶蛋白，由 OAS-1、OAS-2 和 OAS-3 基因编码，具有激活潜在性 RNA 酶(latent Rnase， RNase L)降解病毒 mRNA、抑制病毒蛋白合成和促进病毒感染细胞发生凋亡的作用，在先天性抗病毒免疫中发挥重要的作用1-2。已有研究发现 OAS-1 基因上存在的多个 SNP 可能对丙型肝炎、SARS 等病毒感染性疾病的转归产生影响3-4，目前国内外关于 OAS-1 基因 SNP 对慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染影响的研究甚少，孔晓飞等5发现 SNP rs2660 与 HBV 自限性感染呈弱相关，具体可能机制未能阐述。为此，本
10、研究利用先前建立的相对经济和简便的竞争分化聚合酶链反应6(competitively differentiated polymerase chain reaction， CD-PCR)技术，对 OAS-1 基因上 SNP rs2660 进行基因型检测，探讨它与慢性 HBV 感染者自发性 HBeAg 血清转换的关系，了解检测该 SNP 基因型作为 HBeAg 血清转换预测指标的可能性。31 材料与方法1.1 研究对象收集 2006 年 5 月至 2007 年 5 月在我院感染科就诊的慢性 HBV 感染病例，根据入选前 1 个月内在本院的乙肝两对半检查结果(AXSYM)分成 HBeAg 阳性组和
11、HBeAb 阳性组，两组间的年龄、性别比例、谷丙转氨酶水平均具有可比性。入选标准：年龄 8 30 周岁，无接受 IFN、核苷(酸)类似物等抗 HBV 药物治疗历史，无明确合并 HCV、HDV、HIV 感染，HBeAb 阳性组者 HBV DNA 1 105 拷贝/mL(PE5700 荧光定量 PCR)和血清 HBV 前 C 区 G1896A 变异株阴性(方法参见文献7)。另外收集 72 名无 HBV 感染者作为正常对照。采静脉血 5 mL 肝素抗凝保存于-20 冰箱待检。1.2 引物探针OAS-1 基因 cDNA 的参考序列(GenBank， Acce. No. NC_000012)，引物和探针
12、用 Primer Premier 软件自行设计并由 Invitrogen 公司合成(表 1)，用 Milli-Q 级ddH2O 稀释成 10 nmol/mL。1.3 试剂和设备DNA 提取试剂盒购自美国 Omega 公司，PCR 试剂、T4 DNA 连接酶、E.Coli JM109 感受态细胞和内切酶 Not、 Mlu均购自 Takara 大连公司，质粒载体pCI-neo 购自美国 Promega 公司，DNA 凝胶纯化试剂盒购自德国 QiaGen 公司，辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体(anti-DIC)和异硫氰酸荧光素抗体(anti-FIFC)购自瑞士 Roche 公司。PCR 扩增采用 P
13、TC-200 热循环仪、DNA 测序采用 ABI 3730XL4测序仪，光密度测定采用 Labsystem MK3 酶标仪。 1.4 DNA 提取和基础 PCR扩增取抗凝血细胞 100 L 用 ddH2O 200 L 稀释，用 Omega 试剂盒进行 DNA 提取，DNA 提取终液为 50 L，保存于-20 备用。对 SNP 所在 DNA 片断进行基础PCR 扩增，50 L 反应体系组成：10 PCR 缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2) 5 L、2.5 mmol/L dNTP 液 4 L、DNA提取液 5
14、 L、ddH2O 34 L、引物 OAS1-S 和 OAS1-A 各 1 L、TaqDNA 聚合酶1.5 U;反应步骤：94 预热 5 min、94 变性 40 s、52 退火 40 s、72 延伸 60 s、循环数 35 个、最后延伸 5 min。1.5 制备 CD-PCR 阳性对照质粒 DNA随机取一例基因组 DNA 为模板，上游引物分别为 OAS1-GC 或 OAS1-AC 和下游引物 OAS1-CLA 进行扩增，除引物外 50 L PCR 反应体系组成和反应条件同基础 PCR 扩增，扩增产物经 Not、 Mlu双酶切后进行 2%琼脂糖凝胶电泳，用 QiaGen DNA 纯化试剂盒提取
15、DNA 并与质粒载体 pCI-neo 连接，再用 E.Coli JM109 感受态细胞进行转化，挑取克隆菌落在 LB 培养基增菌，随后提取质粒DNA 作为 CD-PCR 检测两个 SNP 不同等位基因的阳性对照。1.6 CD-PCR 扩增经优化得到 25 L 反应体系：10 PCR 缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2) 2.5 L、2.5 mmol/L dNTP 溶液 0.125 L、Taq DNA 聚合酶 2.0 U、基础 PCR 产物 1.0 L、下游公共引物 OAS1-1 0.10 L、上游混合引物
16、OAS1-G 0.38 L 和 OAS1-A 0.30 L，最后加 ddH2O 至总反应5体积 25 L;PCR 反应条件：94 变性 1 min、56 复性 2 min、72 延伸 2 min、共2 个循环，然后 94 变性 30 s、68 复性 30 s、72 延伸 40 s、最后 72 延伸 5 min，共 20 个循环。1.7 酶免疫显色用 1 缓冲液(0.1 mol/L Na2CO3 和 0.1 mol/L NaHCO3，体积比为 35：65，5 mmol/L EDTA，pH 9.6)配制探针液 OAS1-P(0.04 OD/mL)，然后进行包板。取每个CD-PCR 产物各 10 L 加上下对应两孔，每孔加入 50 L 变性液室温下变性 10 min，随后各孔加入 50 L 中和杂交液，60 水浴 30 min 后洗涤拍干。上孔加入辣根过氧化物酶标记的 anti-DIC 酶标液(1：1 500) 50 L 以检测等位基因 G
