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1、1survivin 反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋 亡及对多西他赛的增敏作用【摘要】 目的 探讨生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)对人胃癌细胞株 SGC7901 的凋亡诱导、对多西他赛的化疗增敏作用。方法 设计合成特异性靶向 survivin ASODN。将胃癌细胞株分为空白对照组(Sham组)、单纯脂质体对照组(Lip 组)、正义寡核苷酸转染对照组(Lip-SODN 组)、ASODN 转染组(Lip-ASODN 组)。转染 48 h 后，Western blot 法检测各组细胞survivin 表达情况,流式细胞仪检测各组细
2、胞凋亡率,MTT 法检测转染细胞对多西他赛的敏感性。结果 脂质体介导 survivin ASODN 转染后的胃癌细胞 survivin 蛋白表达明显下降，细胞凋亡率明显高于各对照组(P0.05)，对多西他赛的 IC50值明显低于各对照组(P0.05)，细胞生长抑制率明显高于各对照组(P0.05)。结论 survivin ASODN 转染胃癌细胞能下调 survivin 蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,增强多西他赛化疗敏感性。 【关键词】 生存素;反义寡核苷酸;胃癌细胞;凋亡;多西他赛;增敏作用Abstract:Objective To investigate the effects
3、of survivin antisense oligonucleotide (ASODN) on the apoptosis and chemosensitivity to docetaxel of the human gastric carcinoma cell line SGC7901. Methods ASODN targeting survivin was designed and constructed. The cultured gastric carcinoma cells were divided into the sham group, lipofectin group, s
4、ense oligonucleotide (SODN) group and antisense oligonucleotide (ASODN) group. After transfection for 48 h, the expression level of survivin in each group was detected by Western blot; the apoptotic rate (AR) was examined by flow cytometry; and the sensitivity of SGC7901 cells to docetaxel was deter
5、mined by MTT.Results The expression of survivin in SGC7901 cells was downregulated after transfection with survivin ASODN; The AR of ASODN group was significantly higher than that of the other groups (P0.05); IC50 of the transfected cells to docetaxel had a significant difference as compared to othe
6、r groups (P0.05), and the inhibitory rate (IR) of ASODN group was significantly higher than that of other groups 2(P0.05).Conclusion The ASODN transfection of gastric carcinoma cells can downregulate the survivin expression, induce cell apoptosis, inhibit cell proliferation and enhance the cell sens
7、itivity to docetaxel, which may help to reverse drug resistance.Key words： survivin; antisense oligonucleotide; gastric tumor cell; apoptosis; docetaxel; chemosensitivity生存素(survivin)属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中的新成员，它可以通过有丝分裂促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，survivin 在调节肿瘤细胞凋亡敏感
8、性方面起着核心作用。本实验采用脂质体介导 survivin 反义寡核苷酸( survivin ASODN )转染人胃癌细胞 SGC7901，以封闭 survivin 基因的表达，观察其对胃癌细胞 SGC7901 的凋亡诱导以及对化疗药物多西他赛的化疗增敏作用。1 材料和方法1.1 材料 胃癌细胞株 SGC7901 购于中国科学院细胞生物研究所。survivin 反义寡核苷酸、错配寡核苷酸(与反义寡核苷酸相同碱基组成、不同排列顺序)由上海生工生物工程公司合成，两端 3 个碱基经硫代修饰以对抗核酸酶的降解;反义寡核苷酸为 5-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3，错配寡核苷酸为
9、 5-GCC ACT CCT CGA CTC TCG TC-3。阳离子脂质体 Lipofectin 购于 Invitrogen 公司。survivin 抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体购于 Santa Cruz 公司，RPMI 1640 购于 Invitriogen 公司，小牛血清购于杭州四季青公司，多西他赛购于Aventis Pharma Dagenham 公司。1.2 方法1.2.1 细胞株培养 人胃癌细胞株 SGC7901 用含 10%小牛血清的 RPMI 1640培养基，在 37、5%CO2 的饱和湿度条件下培养。31.2.2 细胞分组及转染 取对数生长期的 SGC7901
10、，传代接种于 6 孔培养板内，调整细胞密度，使每孔的细胞数为 3105，常规条件下培养 24 h，显微镜下观察，约 80%细胞融合时开始实验。设置空白对照组(Sham 组)、单纯脂质体对照组(Lip组)、正义寡核苷酸转染对照组(Lip-SODN 组)和反义寡核苷酸转染组(Lip-ASODN组)，每组设 3 个复孔。细胞转染过程按转染试剂盒说明书进行，转染 12、24、48 h后收集各组细胞用于后续实验。1.2.3 Western blot 法检测细胞 survivin 蛋白表达 将预冷至 4的匀浆缓冲液加入到经 HBSS 漂洗的培养细胞中,冰上刮取细胞，收集，冰浴中超声破碎(10 s3)，测定
11、蛋白浓度,以 100 g/孔上样,15% SDS-PAGE 凝胶电泳分离,通过电转移法将蛋白质从 SDS-PAGE 凝胶转移至硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜置封闭液中室温孵育 3 h 后,加入一抗(兔抗人生存素抗体,工作浓度为 1500)4孵育过夜,TBST 充分漂洗(5 min3 次),加入 HRP 标记的二抗(羊抗兔 IgG-AP,工作浓度为 1500)37作用 2 h,TBST 充分漂洗(5 min3 次),以 NBT/BCIP 显色,观察结果。1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将收获的各组细胞制成单细胞悬液,加入预冷的 70%冰乙醇,-20内固定 24 h,加 RNA 酶(终浓度为
12、50 mg/L)37反应 1 h，再加入碘化丙啶溶液(质量浓度 100 mg/L)避光染色 30 min 后，在流式细胞仪上检测,应用相应程序软件进行资料的处理和分析。1.2.5 MTT 法检测各组细胞对多西他赛的敏感性 收获的各组细胞用含 10%小牛血清的 RPMI 1640 重悬,倒置显微镜计数细胞,调整细胞密度为 1105/L,并接种于 96 孔板内,每组设置 7 个复孔，其中 1 孔作调零用(空白对照组)，另 6 孔依次加入 0、1、10、20、50、100 g/L 的多西他赛，再各设 6 个复孔。常规条件下培养 48 h,每4孔加入 5 g/L 的 MTT 20 l,继续培养 4 h
13、,倾尽上清。每孔加入二甲基亚砜 0.1 ml,摇床上摇动约 15 min 以充分溶解,用酶标仪在波长 570 nm 处检测各孔光密度值(D 值),计算细胞生长抑制率(IR)=(1-实验组平均 D 值)/空白对照组平均 D 值100%。1.3 统计学处理 采用 SPSS 10.0 软件进行数据处理，应用方差分析、q 检验行差异显著性检验，P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 ASODN 转染后 SGC7901 细胞 survivin 蛋白表达变化 ASODN 转染组survivin 蛋白表达下调,与各对照组比较差异有统计学意义(P0.05);各对照组survivin 蛋白表达无明显改
14、变，各对照组间差异无统计学意义(P0.05)。见图1。与其他组比较：#P0.052.2 ASODN 转染对细胞凋亡率的影响 ASODN 转染可诱导 SGC7901 细胞凋亡, ASODN 作用 48 h 的胃癌细胞，在 G1 期前出现亚二倍体凋亡峰，对照组未见凋亡峰。ASODN 转染组细胞凋亡率明显高于其他组(P0.05),而各对照组间比较差异无统计学意义(P0.05)。见表 1、图 2。2.3 ASODN 转染后胃癌细胞对多西他赛敏感性的检测 各组细胞随多西他赛药物浓度提高，细胞生长抑制率均呈上升趋势，但 ASODN 转染的 SGC7901 细胞生长抑制率明显高于其他各对照组(P0.05)，
15、Sham、Lip 和 Lip-SODN 对照组间差异无统计学意义(P0.05)。见表 2。Lip-ASODN 组 IC50 值为(16.71.98) g/L，而 Sham、Lip 和 Lip-SODN 对照5组分别为(48.51.21) g/L、(46.11.56) g/L 和(44.11.89) g/L，Lip-ASODN 组的IC50 值明显下降(P0.05)。表 1 ASODN 对 SGC7901 细胞凋亡率的影响表 2 各组细胞不同浓度多西他赛作用下细胞生长抑制率测定结果 3 讨 论诱导肿瘤细胞凋亡已成为近年来抗肿瘤治疗的新目标。近年研究1认为，凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式
16、，IAP 家族在调节肿瘤细胞凋亡敏感性方面起着核心作用。多西他赛为紫杉醇类抗肿瘤药，可特异性作用于 M 期细胞，在 GTP 不足情况下诱导 微管蛋白的广泛聚合，同时抑制其解聚，使微管积集成束，通过阻断细胞周期中的 M 期细胞分裂，使细胞不能分化，从而发挥其抗肿瘤作用。目前多西他赛已经成为治疗中晚期胃癌的一线方案。Suzuki 等2采用多西他赛与 TS-1 联合的方法治疗 3 例已经出现胸、腹水的晚期胃癌患者，达到了生存 5 年以上的良好效果。尽管如此，多西他赛在应用过程中仍如其他化疗药一样出现了耐药现象，严重影响了多西他赛的临床应用效果。survivin 是 IAP 家族中相对分子质量最小的成员，定位于人类染色体 17q25，具有抑制细胞凋亡的作用，它的作用远远大于 bc1-2 家族。caspase 级联激活并溶解蛋白质是凋亡发生的核心机制，survivin 可直接作用于 caspase-3、-7，从而阻断凋亡过程3-4，它是一种双重阻断。survivin 的表达具有高度的肿瘤特异
