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1、1MMP-2 在早产儿视网膜病变新生小鼠模 型中的表达【摘要】 目的 检测 MMP-2 在新生小鼠模型中的表达，探讨 MMP-2 在早产儿视网膜病变发病过程中的作用。方法 将 7 日龄 C57BL/6J 小鼠置于 75%2%高氧环境中，5 天后再置于正常空气环境中，建立高氧诱导的早产儿视网膜病变的小鼠模型。于鼠龄 17 天时处死动物并摘除眼球，应用免疫组化方法检测视网膜组织中MMP-2 的表达情况。结果 MMP-2 在对照组和高氧组的积分光密度值分别为16.334.13 和 21.126.29，两者比较有显著性差异(t=3.160，P0.01)。结论 MMP-2 可能对早产儿视网膜病变的新生血
2、管生成有一定作用。 【关键词】 早产儿视网膜病变;MMP-2;视网膜新生血管Abstract:Objective This research using Oxygen Induced Retinopathy model examines the expressions of MMP-2 and inquires its contribution into retinopathy pathology of premature babies. Methods 7-day newborn C57BL/6J rats were raised in standardized incubator and
3、exposed to (752)% oxygen concentration for 5 days, then returned to normal air, in order to establish a rat model of retinopathy pathology of premature babies. Rats were killed on the 17th day of life. Retinas were dissected and stained by immunohistochemical method. Results IOD of MMP-2 was signifi
4、cantly increased 21.126.29 in the ROP group, and 16.334.13 in the control group. There was significant difference (t=3.160，P0.01) in the level of MMP-2 between ROP group and control group. Conclusions It suggests that the existence of MMP-2 in a rat model do exert some effect on the generation of re
5、tinal neovascularization of premature babies retinopathy pathology.Key words:retinopathy pathology of premature babies; MMP-2; retinal neovascularization早产儿视网膜病变(Retinopathy of prematurity，ROP)是发生于早产和低体重儿的一种致盲性视网膜病变，其病理特征为视网膜血管异常增生，严重者可引起玻璃体出血、视网膜变性、视网膜脱离等多种并发症。上世纪 80 年代以来，由于医2疗技术的快速发展，早产儿的成活率也显著提高，
6、ROP 的发病率也随之呈上升趋势，在体重低于 1 000 g 的超低体重儿，发病率高达 80%以上1,2。目前，ROP 已经成为世界范围内儿童致盲的重要原因，约占儿童致盲原因的 6%18%3。防治 ROP 以改善早产儿的生存质量己成为全球关注的焦点。己经明确 ROP 与吸氧治疗高度相关，早产、高氧和低出生体重是发病过程中最为关键的因素，但其发病的确切机制至今仍不明确。研究表明，视网膜新生血管形成在 ROP 的发病机制中起主导作用。尽管近年来人们对视网膜新生血管的认识研究有了不少突破，但由于其确切发病机制仍然不明，目前临床上尚无完全根治性手段。在对视网膜新生血管发生机制的研究中，诸多生长因子、细
7、胞因子和炎症介质发挥的作用一直是关注的重点。近些年来，对基质金属蛋白酶的研究成为热点。本研究在早产儿视网膜病变的小鼠模型中，应用免疫组化方法，检测了基质金属蛋白酶 2(MMP-2)的表达，进一步探讨 MMP-2 在早产儿视网膜病变发病过程中的作用。1 材料和方法1.1 实验动物中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供的健康的清洁级 C57BL/6J 幼鼠(与哺乳母鼠在一起)，选择鼠龄 7 天的共 40 只，雌雄兼有。1.2 实验试剂MMP-2 免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。31.3 早产儿视网膜病变小鼠模型的建立选择鼠龄 7 天的健康清洁级 C57BL/6J 幼鼠 40 只，
8、与哺乳母鼠在一起，雌雄兼有，随机分成 2 组，高氧组 20 只，对照组 20 只。对照组在正常环境温度下饲养;高氧组置于密闭有机玻璃容器内。容器内接入 100%湿润医用纯氧气，使容器内氧分压保持在 75 %2 %，并用测氧仪全程监测容器内的氧分压，确保氧浓度的恒定。高氧环境下饲养 5 天，然后移置正常环境温度中饲养。每天日光照明 12 小时，环境温度控制在(232)。每日打开氧箱更换垫料、加食、替换母鼠 1 次。1.4 标本的制备鼠龄 17 天时处死幼鼠，将眼球摘除，浸泡于 4 %多聚甲醛中性缓冲液中固定24 小时，保存温度为 4 。梯度酒精脱水、二甲苯透明，常规石蜡包埋。标记方向，制作切片时
9、应避开视乳头周围，含有视神经的切片应排除在外。连续切片，厚度 6 m，切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位平面。1.5 免疫组化法按照即用型 SABC 免疫组化试剂盒使用说明书进行操作：石蜡切片置于 60 烘箱 23 小时溶解石蜡，二甲苯常规脱蜡至水，0.3%过氧化氢室温孵育 510 分钟，切片置于抗原修复液中 9298 水浴 10 min，室温中冷却 20 min。滴加5%BSA 封闭液，滴加适当稀释的一抗(1：150)，4 过夜。次日滴加生物素标记的二抗工作液，置湿盒内 37 ，滴加试剂 SABC，室温孵育 30 min。DAB 显色：使用 DAB 显色剂试剂盒，取蒸馏水 1 mL，加试剂盒
10、中 A、B、C 试剂各一滴，混匀后加至切片，室温避光 10 min。苏木素复染 1 min，脱水、透明、封片、镜下观察。41.6 统计学分析实验数据采用均数标准差表示，所有数据均以统计分析软件 SPSS 11.5 for windows 进行分析，采用独立样本 t 检验方法，以 P0.05 作为差异有统计学意义的标准。2 结 果2.1 MMP-2 在视网膜的表达MMP-2 以背景清晰细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，主要位于视网膜内界膜附近，神经节细胞层，内核层。 2.2 免疫组化的半定量检测每张切片在高倍显微镜下随机选择 10 个视野，采用 Metamorph/DP10/BXS 1图像分析软件，测
11、量其积分光密度值(IOD 值)，MMP-2 在对照组和高氧组的积分光密度值(IOD 值)分别为 16.334.13 和 21.126.29，两者比较有显著性差异(t=3.160，P0.01)。3 讨 论研究认为早产儿视网膜病变的主要病理改变为视网膜新生血管生成，而视网膜新生血管的发生过程是从预先存在的血管形成新的毛细血管，因此在其最初阶段必须使血管内皮细胞趋化、迁移通过基底膜，而这一过程必须通过基质金属蛋白酶消化血管内皮细胞层下面的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)屏障4。基质金属蛋白酶是一类活性依赖锌离子和钙离子的可以降解细胞外基质的蛋白水解酶，包括约 20 种酶
12、，主要分为胶原酶类(MMP-1、MMP-8、MMP-513、MMP-18 ) ，明胶酶类(MMP-2、MMP-9)，基质水解酶类(MMP-3、 MMP-10、MMP-11)，膜型酶类(MT -MMP)等，它们的分子量从 20100 kDa 不等，作用的底物有一定的重叠性，其中明胶酶的作用主要是清除变性的胶原和型胶原。而型胶原是组成血管基底膜和细胞外基质的主要结构蛋白，因而明胶酶 MMP-2 作为主要降解型胶原的基质金属蛋白酶在新生血管形成过程中起着重要作用5。研究表明，MMP-2 与新生血管形成密切相关6。MMP-2 通过降解变性的胶原和基底膜型胶原，有利于血管内皮细胞的迁移，并为毛细血管网络
13、增生提供了空间，而基底膜和间质胶原的降解产物对内皮细胞也有趋化作用，有利于血管内皮细胞的定向迁移，从而引起新生血管的形成。一些研究团体已经检测了在视网膜新生血管中 MMPs 的表达形式和可能的作用。Das 等7报道糖尿病人视网膜外层新生血管膜含有高水平的细胞外蛋白水解酶，其中包含 MMP-2、MMP-9 和尿激酶。Majka 等8报道在小鼠增殖性视网膜病变模型中 MMP-2、MMP-9 和 I 型 MMP 的表达增加。Das 等9报道氧诱导的视网膜病变模型中，腹膜内注射 MMPs 抑制剂可显著抑制视网膜新生血管的生成。我们通过建立高氧诱导的视网膜新生血管小鼠模型，发现高氧组 MMP-2 的表达
14、明显高于对照组，提示 MMP-2 与视网膜新生血管生成之间存在关联。Kyoko Ohno-Matsui，Tomoko Uetama 等10建立了氧诱导的视网膜病变小鼠模型，发现 MMP-2 缺乏型(MMP-2-/-)的小鼠视网膜外新生血管形成明显少于野生型小鼠(MMP-2+/+)，这也可以证实我们的结论。因此认为 MMP-2 可能是视网膜新生血管形成的调节中所必须的。也有研究认为11， MMP-2 无论对小鼠视网膜血管生成还是病理性视网膜新生血管生成都不是必不可少的。用 MMP-2 抑制剂进行干预将成为治疗早产儿视网膜病及其他新生血管性视网膜病的新途径。6【参考文献】1 Palmer EA，F
15、lynn JT，Hardy RT,et al. Incidence and early course of retinopathy of prematurityJ. Ophthalmoloty，1991，98(11):1628-1640.2 Joao Borges Fortes Filho，Cristiano Koch Barros. Retinopathy of prematurity in a tertiary center in south of BrazilJ. International Journal of Ophthalmology，2007，7(1):31-35.3 Gilbe
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