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1、1CpG ODNs 抗感染免疫作用研究进展【关键词】 CpG ODNs；Toll 样受体（TLRs）；免疫；感染哺乳动物的免疫系统依赖于天然免疫和获得性免疫防御病原微生物的入侵。天然免疫是机体的第一道防线，它在病原微生物入侵时首先被激活，表达于细菌、病毒、真菌的病原相关分子模式 (pathogenassociated molecular patterns,PAMPs)被模式识别受体 (pattern recognition receptor，PRR)识别。不同微生物感染所表达的PAMPs 可激活天然免疫系统，这些被激活的天然免疫应答在体内可控制感染有机物的增殖和传播，随后宿主对病原体特异性表达
2、产生相对应的获得性免疫应答，为机体提供长期的保护作用。细菌 DNA 是一种以 Toll 样受体家族（Toll like receptors，TLRs）为模式识别受体的 PAMPs，其免疫作用基础是未甲基化的 CpG 基序（CpG motif），该基序在原核生物细菌中存在的水平远远高于真核生物，天然免疫系统通过 TLRs 检测这些未甲基化的 CpG 基序，进入免疫应答状态1。炎症过程中未甲基化 CpG DNA 的释放为天然免疫系统提供“危险信号”，引发能够增强宿主消除抗原能力的保护性免疫反应。大量研究显示细菌 DNA 中所含的 CpG 基序或人工合成的 CpG 寡聚脱氧核苷酸（CpG oligo
3、deoxynucleotides,CpG ODNs）均具有强烈的免疫调节功能，可以快速引发机体的抗感染免疫2。本文仅就 CpG ODNs 抗感染免疫研究进展作一综述。1 CpG ODN 抗感染免疫作用机制1.1 CpG ODN 结构基础 CpG 基序的核心是胞嘧啶核苷酸(dC)和鸟嘌呤核苷酸(dG)，CpGDNA 是否具有免疫活性关键取决于 dC 的第 5 位碳原子是否被甲基2化，如果胞嘧啶发生甲基化,则其活性丧失，CpG 基序的免疫刺激活性不仅依赖于其核心 CpG 二核苷酸，而且这两个核苷酸的种类和序列也不能随意改变，破坏或将 CpG 变为 GpC，其免疫刺激活性也随即消失3。细菌 DNA
4、能够激活多种免疫细胞，其结构基础是未甲基化的 CpG 二核苷酸为核心的短核苷酸序列（一般为 6个核苷酸），即 CpG 基序。Krieg 等4观察到一些含有 CpG 基序的 DNA 序列能够激活小鼠的 B 淋巴细胞，同时发现将 CpG 换成 GpC 或者将 CpG 基序甲基化均使其免疫刺激作用消失。人工合成的、含 CpG 基序的 CpG ODN 能够模拟 CpG DNA 的免疫刺激作用，这些具有免疫刺激作用的 ODN 至少有 8 个碱基并且含有 CpG 基序。1.2 CpG ODN 细胞内信号转导机制 CpG ODN 可快速进入免疫细胞，现在已经明确 CpG ODN 的信号转导大致如下：首先 C
5、pG ODN 通过受体介导的形式被细胞摄取，这一过程需要能量且呈温度、时间依赖性。CpG ODN 被摄入后，通过PI3K 进入内吞小体，此时 TLR9 已从内质网移至成熟小体，在内吞小体中 TLR9与含有 CpG 基序的序列发生特异性结合并相互作用。这种高度特异的相互作用通过倒置或甲基化 CpG 引发病原清除。TLR9 和 CpG ODN 的相互作用导致内吞小体的膨胀、酸化以及产生反应性氧，这一系列事件对 CpG 介导的信号传导至关重要。包括 TLR9 在内的 TLR 家族多数成员可引起细胞活化，其信号传导通过共有的通路，包括髓样分化因子 88（MyD88），IL1 受体相关激酶（IRAK）、
6、TNF 受体相关因子 6（TRAF6）。TLR9 信号转导最终激活的转导因子有NFK、AP1、CEBP 和 CREB，这些转导因子直接上调各种细胞因子及趋化因子的表达5。3TLR9 的活化导致经典的 TLRs 信号级联：MyD88IRAK TRAF6,最终激活MAP 激酶和 NFB 等转录因子，这些转录因子最终启动促炎症系统产生抗感染免疫反应6。2 CpG ODN 抗感染免疫作用2.1 参与 CpG ODN 抗感染的免疫细胞 很多实验表明，CpG 诱导后产生保护作用的主要细胞是浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoid dendritic cells,pDCs)，其理论基础是CpG ODN
7、可刺激 pDCS 表达 I 型 IFN，I 型 IFN 可通过激活巨噬细胞活性限制病毒和细菌的生长，破坏其致病效力。listeria 等感染后，敲除 pDC 的鼠在注射 CpG ODN 后对感染无保护作用7。除了 pDC 外，其他细胞也参与了 CpG 介导的保护反应。例如，B 细胞可表达TLR9 通过 CpG ODN 直接刺激产生多效能的免疫球蛋白，减少相应的致病菌。同样，巨噬细胞、大鼠系膜细胞（MC）等均可在 CpG 刺激免疫应答反应中产生 IFN而对致病菌起作用。在大鼠腹膜炎动物模型中 CpG 基序可介导大鼠肝脏自然杀伤细胞及巨噬细胞内表达高水平的 TLR9 ，释放大量的炎症细胞因子控制细
8、菌感染8。 2.2 CpG ODN 可抵御多种感染性疾病 CpG ODN 可抵御诸如疱疹、腹膜炎、肝炎、肾小球肾炎等多种疾病。鱼、鸟及哺乳类动物对细菌 DNA 具有识别和应答反应。数亿年来 CpG 的进化说明 CpG 介导的免疫活化作用对宿主提供保护作用。为研究这一假设，学者们在鼠体内注入细菌 DNA 或 CpG ODN 用于抵抗各种致病病原体。受试动物用致病病原体包括高剂量炭疽热病毒、李斯特菌属（Listeria）以及土拉菌病病毒、疱疹病毒，同时还包括黑热病、疟疾等寄生虫的侵袭。在感染上述病毒的几天内，CpG ODN 免疫活性达到最高峰9。在感染鼠体内4接种 CpG ODN 可显著增强其细胞
9、免疫和体液免疫，同时也可以有效提高感染大肠杆菌的猪的免疫保护及防御能力10。新生鼠感染小球隐孢子虫致腹腔炎症后6 d 内，腹腔内注射 CpG ODN 或口服给药均可控制和减缓腹腔炎症，作者认为可能存在两种作用机制，一是 CpG/TLR9 相互作用和影响可释放各种炎症细胞因子激活免疫细胞，二是推测存在一种新的不依赖于 TLR9 的 CpG 抗感染作用机制11。Kodama 等12在鼠的动物实验中也证实：经由鼠鼻部吸入给予 CpG ODN可安全有效的治疗上呼吸道感染。另有研究表明：CpG ODN 可减缓或预防病理性免疫刺激，包括自身免疫性疾病、如肾小球肾炎以及感染性休克等疾病13，14；也可对金葡
10、菌感染诱发大鼠乳腺炎的乳腺产生保护作用15；持续 14 d 注射 CpG ODN，可减轻 Balb/c 鼠的口蹄疫病症，有效控制其疾病的传播和蔓延16。2.3 CpG ODN 可增强抗感染免疫能力 CpG ODN 也可增强免疫抑制能力。感染HIV 患者的 CDT 细胞的数量及作用活性呈现渐进性降低（同时增加了其机会性感染的可能）。灵长类单核淋巴细胞在病毒感染后仍可继续对 CpG ODN 刺激产生应答反应。在对 SIV（simianimmunodeficiency virus ）感染的短尾猿的研究中，发现对人类起作用的 D 型 ODN 对利什曼病虫感染具有保护作用。而在快速感染SIV 病毒的短尾
11、猿实验组，应用 CpG ODN 治疗后寄生虫结节被降低 1 000 倍17。对孕期鼠研究显示：CpG ODN 治疗可显著增强其对诸如 listeria 等细菌感染的免疫性，避免孕期及新生儿动物的感染，同时降低母婴之间靠胎盘所传导的病原体感染。CpG ODN 抗感染免疫已在临床研究中应用。如将 CpG ODN 作为佐剂利用双盲法应用于乙型肝炎疫苗 Engerix B 中，健康成人受试者在 CpG ODN+疫苗联合应用组较单独用疫苗组 IgG 抗体应答产生更为迅速。在初次免疫及再次免疫后其平5均抗体产生分别提高 1345 倍18。同单独应用 Fluarix 疫苗相比，应用加 CpG ODN 后的
12、Fluarix 流感疫苗，机体先天性抗体应答没有升高，但个体中流感病毒特异性抗体数量显著上升19。这些研究均表明通过控制致病菌早期生长和繁殖速度，CpG 治疗可提高宿主免疫能力，进而产生抑菌的获得性免疫应答。需要注意的是这些应答并不能防御所有致病原。CpG ODN 也可引起鼠对关节感染疾病的易感染性增强。一些实验结果显示：在特定的条件下，CpG 基序也可引起有害的自身免疫应答的发生20。CpG ONA 可引起宿主免疫应答从而提高宿主抵御各种病原微生物感染的能力，对加速免疫反应诱导快速的抗感染免疫应答至关重要。未甲基化 CpG 基序具有引发先天性免疫系统应答的能力确保其对生物攻击提供防御反应，成
13、功地执行了免疫策略中的“警铃 ”作用，易感染体的靶向介定可减少致病原传递的可能，进而增强对感染的共同防御。TLR9 介导的 CpG ODN 引起的各项作用可能帮助我们对天然免疫系统更好地了解，并为感染性疾病的免疫治疗提供依据。【参考文献】1 Hemmi H,Takeuchi O，Kawai T,et al.A Tolllike receptor recognizes bacterial DNAJ.Nature，2000；11(7):7405.2 Krieg AM.Therapeutic potential of Tolllike receptor 9 activationJ. Nature R
14、ev Drug Disc,2006；5(6):47184.3 向 一,余青松,祁 智，等.CpG ODN 纳米粒增强免疫抑制小鼠对重组乙肝疫苗的免疫应答J.中国药师,2007；10(3):2037.4 Krieg AM，Yi AK，Matson S,et al.CpG motifs in bacterial DNA trigger direct Bcell activationJ.Nature,1995；374(6522):5469.5 Yamamoto M，Sato S，Mori K,et al.Cutting edge：a novel Toll/IL1 receptor 6domainco
15、ntaining adapter that preferentially activates the IFN promoter in the Tolllike receptor signalingJ.J Immunol,2002；169(12)：666872.6 Bauer S，Wagner H.Bacterial CpGDNA licenses TLR9J.Curr Top Microbiol Immunol,2002；270:14554.7 McCluskie MJ，Krieg AM.Enhancement of infectious disease vaccines through TL
16、R92dependent recognition of CpG DNAJ.Curr Top Microbiol Immunol，2006；311:15578.8 Tsujimoto H，Ono S，Matsumoto A,et al.A critical role of CpG motifs in a murine peritonitis model by their binding to highly expressed tolllike receptor9 on liver NKT cellsJ.J Hepatol，2006;45(6):83643.9 Gomis S，Babiuk L，Godson DL,et al.Protection of chickens against Escherichia coliinfections by DNA containing CpG motifsJ
