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1、1IL17 在沙眼衣原体呼吸道感染中的早 期表达及其与机体防御关系作者：张效云 徐志伟 高丽芬 陈丽丽 钟光明【摘要】 目的:探讨炎症性细胞因子 IL 17 在沙眼衣原体呼吸道感染中的早期表达及与机体防御的关系。方法:用沙眼衣原体小鼠肺炎株(MoPn)通过鼻腔感染小鼠，用 IFA 检测衣原体在肺组织的生长;通过 ELISA 检测小鼠肺组织IL 17、IL 6、IL 8、TNF 、IL 1 和 IL 1 等炎症性细胞因子表达。结果:MoPn 感染后第 1 天，肺组织有衣原体生长，于感染后第 8 天达高峰;感染后第 2天，IL 17 在小鼠肺组织中的表达达峰值，并很快下降;TNF、IL 1、IL
2、1 和IL 6 在感染后第 3 天达到峰值，而 IL 8 则在第 8 天出现高峰。结论:IL 17 在衣原体肺炎早期出现，能提高局部 IL 6，IL 8,TNF ,IL 1,IL 1 的表达。这些结果显示 IL 17 早期表达可能作为固有免疫反应成分在起动宿主抵御细胞内病原体感染中发挥重要的作用。 【关键词】 衣原体/沙眼;IL 17;呼吸道感染;小鼠【ABSTRACT】 Objective:To evaluate the early IL 17 expression in Chlamydia trachomatis respiratory infection and its relation
3、ship with immune defence. Methods:A murine model of pneumonia induced by intranasal inoculation with Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis(MoPn,now classified as a new species C.muridarum)biovar was used for the study. Chlamydial growth in the lung was assessed by inoculating HeLa cell monolayer w
4、ith lung homogenates followed by IFA. IL 17 and other cytokines such as TNF,IL 6,IL 8,IL 1and IL 1were measured by ELISA. Results:Chlamydial growth in the lung was found on the 1st day after infection,and reached its peak on the 8th day with subsequent decline in quantity. IL 17 peaked at 48h while
5、other cytokines peaked on the 3rd day(e.g. TNF,IL 6,IL 1and IL 1)or later(IL 8). Conclusion:IL 17 is produced early in 2airway upon Chlamydia trachomatis,it can enhance high production of TNF,IL 6,IL 8,IL 1and IL 1 in the lung. These suggest that an early IL 17 response as an innate immunity compone
6、nt should play an important role in initiating host defense against infection with Chlamydia trachomatis in the airway.【KEY WORDS】 Chlamydia Trachomatis,IL 17,Respiratory Tract Infections,Mice沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)是一类严格细胞内寄生的病原体，能引起多种人类和动物疾病，包括沙眼、生殖道感染、不孕不育和肺炎等,对人类的危害性很大。小鼠模型研究表明，CD4+Th 细胞(Th1
7、 而非 Th2)和依赖 IFN 的免疫反应是宿主控制衣原体感染的主要保护性因素1，抗体和 CD8T 细胞也可能在宿主抵御衣原体感染中发挥作用2。然而，Th17 细胞和其分泌的细胞因子 IL 17 在沙眼衣原体感染中的作用尚不清楚。初始 CD4+T 细胞可被诱导从而表达转录因子 RORt，并分泌细胞因子IL 17，分化成为除了 Th1 细胞和 Th2 细胞之外的一种新的 Th 细胞亚型 Th173。IL 17 家族包括 IL 17(IL 17A),IL 17B F。IL 17 和 IL 17F 主要由活化的CD4+T 细胞产生，参与宿主固有免疫应答如中性粒细胞募集及活化4。IL 17 可在不同的
8、组织诱导前炎症反应或抗炎症反应，诱导 IL 6、粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)和细胞间黏附因子 1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM 1)的产生5,6，另一方面，IL 17 也能阻止肿瘤坏死因子(TNF a)诱导的趋化因子 RANTES 和干扰素诱导蛋白10(IP 10)的分泌7,8。IL 17 做为前炎症因子在许多疾病中发挥作用,例如，用抗 IL 17 单克隆抗体处理的小鼠能抑制中枢神经系统的自身免疫性疾病9。缺乏产生 Th17 细胞的小鼠能抵抗实验性自身免疫性脑
9、脊髓炎(EAE)、胶原蛋白诱导的关节炎和炎症性肠病(IBD)9,10。本研究以鼠衣原体肺炎为模型，研究衣原体3感染不同时间 IL 17 的表达，发现 IL 17 在感染衣原体后在固有性免疫应答早期阶段短暂表达，随后很快下降，但其他细胞因子IL 6,IL 8,TNF ,IL 1,IL 1 则分别在第 3 天或第 8 天出现高峰，基于这些资料我们认为 IL 17 在衣原体肺炎早期出现，能提高局部IL 6,IL 8,TNF ,IL 1,IL 1 的表达，从而提高机体抗感染固有免疫应答能力。1 材料与方法1.1 实验材料 主要试剂:IL 17 试剂盒与其他细胞因子的试剂盒均购自RD systems 公
10、司,组织匀浆器购自 Fisher Scientific 公司，Hoechst 染料购自Invitrogen。Cy2 标记羊抗兔 IgG(绿)和 Cy3 标记羊抗鼠(红)购自 Jackson 免疫制剂公司(PA,USA)。主要仪器:CO2 培养箱(Formo,USA);荧光生物显微镜(AX270 equipped with a CCD camera,Olympus,Japan);酶标仪(Molecular Devices Corporation,USA)。1.2 沙眼衣原体株 沙眼衣原体小鼠肺炎株(MoPn,由 Dr.ZHONG 实验室提供)生长于 HeLa 229 细胞,用不连续密度梯度离心法
11、纯化衣原体原体(EB),进行活性测定后用于感染小鼠，具体方法参见文献11。1.3 实验动物及感染 89 周龄雄性或雌性 C57BL/6 小鼠,体重 1820g，均购自 Jackson laboratories,Bar Harbor,Maine。随机分组,每组 68 只，依不同处死时间点，分为 8 个研究组及相应的 8 个对照组。标记动物,分笼颗粒饲料饲养,温度1824,光暗周期 12h。自由饮水进食。研究组在微麻状态下鼻腔内吸入 40L含 4103MoPn 包涵体形成单位(IFU)的 SPG(蔗糖磷酸盐缓冲液),对照组吸入等4量 SPG。在感染后不同时间处死研究组小鼠及相应对照组小鼠。1.4
12、肺组织匀浆制备 无菌采集小鼠全肺,在冰上用 2mL 玻璃研磨器加入1.5mL SPG 制备成组织匀浆，经超声后，在 4，6000rpm/min 离心 15min,上清液用来进行 IFU 计数和细胞因子的测定。1.5 衣原体活性测定 选取消毒灭菌后盖玻片放入 24 孔培养板内,收获培养24h 左右的 Hela 细胞，经胰蛋白酶消化、记数后，用含 10S 的 DMEM 稀释至 8104/mL,每孔加 1mL,37及 5%CO2 条件下培养过夜。将生长在盖玻片上的单层 Hela 细胞，移去培养基,用 DMEM 洗一次，加入 0.5mL 30g/mL 的 DEAE 葡聚糖,3710min。弃掉 DEA
13、E,加入适当稀释的肺组织匀浆上清液,每孔 200L,室温下 1000rpm/min 离心 1h,吸去上清液，加入含有 2g/mL 放线菌酮(cycloheximide)、10g/mL 庆大霉素及 100mL/L FBS 的 DMEM,每孔 1mL,375% CO2 条件下培养 22h。吸掉培养基,用 1PBS 洗一次,加入含有 2%PF 的 1PBS0.5mL,室温固定 30min,然后加入含有 2%Sapornin 的 0.05%PBST 室温 1h。吸掉孔内液体,加入含 10S 的 DMEM0.5mL，37封闭 1h。吸掉孔内液体加入一抗(含 10S 的 DMEM10mL,RCT395 5
14、L,MB5H9 100L,由Dr.ZHONG 实验室提供)，37作用 1h。用 1PBS 洗 3 次,每次放置 5min，最后风干。加入 20L 二抗(1mL 10S DMEM,5L GRIgGCy2,5L GM IgGCy3,2L hoechst),37作用 1h。用 1PBS 洗 3 次每次放置 5min，然后封片,在荧光显微镜下计数包涵体个数以 IFU 表示。每个盖玻片随机计数 5 个视野，若视野不足 1 个 IFU 的，计数整个盖玻片,呈明显细胞毒性的细胞不在计数之内。每个器官的总 IFUs 计数为每个视野的 IFUs,每个盖玻片的计数视野，肺组织上清液的稀释倍数和总体积的综合计数。1
15、.6 统计分析5结果用均数标准差(xs)表示，组间差异用 t 检验。2 结果2.1 衣原体在小鼠肺组织的生长 用小鼠肺组织匀浆做衣原体活性测定,于感染后第 1 天，Hela 细胞内可见有衣原体包涵体生长，IFU 数值随着感染进程持续增高，于感染后第 8 天 IFU 达峰值,以后逐渐下降(图 1)。图 1 MoPn 呼吸道感染小鼠肺组织 IFU 生长计数 2.2 衣原体 MoPn 肺感染早期诱导 IL 17 的表达 用小鼠肺组织匀浆进行 IL 17 ELISA 测定，发现 IL 17 表达在感染 48h 后达到峰值(图 2)，但 IL 17 的产生是暂时的，到第 4 天，几乎检测不到明显的 IL
16、 17 表达(IL 17ELISA 试剂盒的工作范围是 15.61 000pg/mL)。图 2 MoPn 呼吸道感染小鼠肺组织 IL 17 的表达 2.3 衣原体 MoPn 肺感染诱导前炎症细胞因子和趋化因子的表达 本实验同时测定了小鼠肺组织匀浆TNF(图 3 1)、IL 1(图 3 2)、IL 1(图 3 3)、IL 6(图 3 4)和 IL 8(图 3 5)的表达情况，这些细胞因子在整个感染过程中均可检测到，TNF、IL 1、IL 1和 IL 6 在感染后第 3 天达到峰值，而 IL 8 则在第 4 天出现高峰。 3 讨论IL 17 在炎症病理和宿主防御多种微生物感染中具有重要的作用。然而，IL 17 在由严格的细胞内寄生病原体如沙眼衣原体引起的感染中的作用尚不清楚。本研究用沙眼衣原体体内感染模型证实 IL 17 在感染衣原体后在固有性免疫应答早期阶段短暂表达，从而有利于小鼠肺组织逐渐
