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1、1CO2 气腹压力和持续时间对人结肠癌细 胞增殖的影响作者：李旭，周西华，蔡景理，叶乐驰，陈荣，郑晨果【摘要】 目的 ：研究 CO2 气腹压力和持续时间对人结肠癌 SW480 细胞增殖的影响。方法：建立体外模拟 CO2 气腹环境，在全自动气腹机作用下，维持密闭真空压缩袋内不同压力(9、12、15 mmHg)，不同持续时间(1、2、4 h)作用于 SW480 细胞，作用后 12 h，流式细胞仪观察细胞周期变化;作用后 12、24、36、48、60 和 72 h，MTT 法检测细胞增殖情况。结果：流式细胞仪检测细胞周期结果显示，CO2 气腹压力对于人结肠癌 G0/G1 期细胞数值有显著影响(P 0
2、.01)，对于 S 期、G2/M期细胞周期无影响。而不同 CO2 气腹持续作用时间对于各细胞周期无影响(P 0.05)， CO2 气腹压力与作用时间对于各细胞周期不存在交互作用(P 0.05);MTT 法结果显示 CO2 气腹下各组人结肠癌 SW480 细胞在不同压力和持续时间作用后 1272 h 检测的平均 D(490)值均小于对照组。通过析因设计的方差分析，在 CO2 气腹作用后 12、24、36、48、60 和 72 h，压力与作用时间对 SW480 细胞的增值无交互作用(P 0.05)。压力在 24、36 h 对 SW480 细胞的增值有一过性抑制作用(P 0.01)，在 SW480
3、细胞增殖初、后期都无影响(P 0.05);不同作用时间对 SW480 细胞的增值无影响(P 0.01)。结论：CO2 气腹不同压力对结肠癌细胞的增殖有一过性抑制作用，CO2 气腹 72 h 内不同作用时间对结肠癌细胞的增殖未见明显影响。 【关键词】 CO2 气腹;结肠癌细胞;腹腔镜;增殖;细胞周期2Abstract: Objective: This study aimed to explore the influence of CO2 pneumoperitoneum administered with different pressures and exposure time multipl
4、ication of cultured human colonic cancer cells. Methods: SW480 was subjected to a simulated laparoscopic CO2 pneumoperitoneum environment at various CO2 pressures (9，12 and 15 mmHg) and exposure time(1，2 and 4 h). Cellscultured in a standard environment were used as the control. The cell cycle were
5、examined by flow cytometry after they were moved to normal conditions for 12 h ;the cell proliferation ofSW480 cells was examined with MTT method after they were moved to normal conditions for 12，24，36，48，60 and 72 h，respectively. Results: The results of colonic cancer cell cycle measured with flow
6、cytometry showed that CO2 pneumoperitoneum administered with different pressures hadsignificant affect on the the numerical values of G0/G1 phase(P 0.01)，however no affect on the numerical values of S，G2/M phase. CO2 pneumoperitoneum administered with different xposuretime had no significant influen
7、ce on the cell cycle(P 0.05). There was no interaction betweenCO2 pneumoperitoneum pression and exposure time (P 0.05). After exposed to different CO2pneumoperitoneum pressure and exposure time (1272 h)，the average absorbance values(490)of human colonic cancer SW480 cells examined by MTT assay were
8、decreased compared with the controlgroup. There was no interaction between CO2 pneumo-peritoneum pressure and exposure time(P 0.05)for the proliferation viability of SW480. The CO2 pneumoperitoneum pressure had temporary effectfor the proliferation viability of SW480 at 24 h and 36 h (P 0.01)， and n
9、o effect for the primaryand anaphase of cell proliferation of SW480(P 0.05). The proliferation viability of SW480 exposedwithin different time was not statistically different (P 0.01). Conclusion: CO2 pneumoperitoneumadministered with different pressures can temporarily inhibit the growth of human c
10、olonic cancercells;CO2 pneumoperitoneum administered with different exposure time does not promote the growthof human colonic cancer cells.Key words: CO2 pneumoperitoneum;colonic cancer cells;laparoscopes;proliferation;cell cycle多项 RCT 研究显示，腹腔镜结直肠癌手术与开腹手术具有相当的近、远期疗效，美国结 直肠癌外科医师协会已将其列为治疗结直肠癌的标准手术方式之一
11、1。然而腹腔镜所需的气腹改变了腹腔内原有的压力以及高浓度 CO2 改变了结肠癌细胞原有的生存环境，是否会因此促进肿瘤的增殖，提高播散率与转移率临床上尚有争议2。本研究拟通过体外模拟 CO2 气腹环境，观察其对人结肠癌SW480 细胞增殖的影响，探讨 CO2 气腹的压力、持续时间与结肠癌细胞增殖之间的关系。31 材料和方法1.1 主要试剂及仪器人结肠癌 SW480 细胞株(中科院上海细胞库)，二甲基亚枫(DMSO)购于 Sigma公司，小牛血清购于杭州四季青公司，RPMI 1640 购于美国 hyclone 公司，碘化丙啶染液(PI)购于杭州联科公司，胰蛋白酶购于美国 Gibco 公司，MTT
12、试剂盒购于南京凯基公司，细胞培养板购于德国 Greiner 公司，全自动气腹机购自德国 MGB公司，流式细胞仪购于美国 BD 公司，电子 PH 计购于瑞士 Mettler 公司，680 酶标仪购于美国伯乐公司。1.2 方法1.2.1 人结肠癌 SW480 细胞的培养：选用人结肠癌 SW480 细胞，在含有 10%小牛血清的 RPMI1640 培养液中培养。置于 37 、5% CO2 密闭细胞培养箱中，每 2 d 更换 1 次培养液。取对数生长期细胞用于实验。1.2.2 体外气腹模型的建立：见图 1。选 45 cm70 cm 大小的塑料真空压缩袋(环氧乙烷熏 蒸消毒)，袋内置一大小约 25 cm
13、40 cm 的平低塑料筐(消毒方法：紫外线照射半小时。作用：保持平衡，防止通气时压缩袋内培养板倾斜，培养液外流)，压缩袋气嘴口用橡皮塞封 闭，用直径约 1 cm 的玻璃管自橡皮塞中间插入，玻璃管另一端通过胶皮管连接全自动气腹机。培养板或培养瓶放入真空压缩袋内的平底塑料筐内，袋口折叠 23 次，用宽透明胶带密闭后，用抽气筒抽尽袋内空气，然后打开全自动气腹机，调整到所需压力后通入 99.5%医用 CO2 气体。1.2.3 分组：气腹组共 9 组：CO2 气腹压力分别设定为 9、12 和 15 mmHg，作用4时间分别为 1、2、4 h，处理后放置在与对照组相同的环境中继续培养(气腹组分别以压力-时
14、间表示为 9 mmHg-1h，9 mmHg-2 h，9 mmHg-4 h，12 mmHg-1 h，12 mmHg-2 h，12 mmHg-4 h，15 mmHg-1 h，15 mmHg-2h，15 mmHg-4 h 共 9 组)。对照组：直接放入 37 、5% CO2 细胞培养箱中培养，培养时间同实验组。1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期变化：将处于对数生长期的人 SW480 结肠癌细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为 1.0105/mL，分别取 5 mL 加入到 50 mL的细胞培养瓶中(每个培养瓶含细胞约 5.0105 个)。CO2 气腹环境中处理后放在37 、5% CO2 细胞培养箱中继续
15、培养 12h。取出培养瓶，0.25%胰酶消化、置于离心机中，离心，弃上清，加入 1 mL PBS 重悬 10 min，把细胞悬液加入到 4 mL、-20 的 75%乙醇中，然后置于-20 的冰箱中放置 10 min，同上法再离心，弃去酒精，再加入 5 mL PBS 重悬 10 min，再次离心，弃上清，最后加 1 mL 碘化丙啶染液(PI)重悬 30 min 后，置于流式细胞仪行细胞周期分析。1.2.5 MTT 法检测细胞增殖活性 取单细胞悬液，调整细胞浓度为 1.0 104/mL，接种于 96 孔培养板中，每组设 6 个复孔，每孔加入细胞悬液 100L(即每孔约含细胞 1.0103 个)，置
16、 于 37 、5% CO2 细胞培养箱中培养 24 h 待细胞贴壁后按 1.2.3 方法分组处理，处理后置入 37 、5% CO2 细胞培养箱中培养，并分别于第 12、24、36、48、60 和 72 h 各取 6 个复孔，每孔 加入 50L 的MTT，继续培养 4 h 后，用 2 mL 注射器小心吸出培养液和 MTT 溶液，然后每孔再加入 DMSO 150L，振荡器微振荡 10 min 后，置于全自动酶标仪于 490 nm 处测定各孔吸光度值D(490)，取均值，绘制生长柱状图。1.3 统计学处理方法5压力与时间两因素析因设计资料采用方差分析。2 结果2.1 CO2 气腹压力与作用时间对人结肠癌 SW480 细胞周期的影响为了解 CO2 气腹压力与作用时间是否存在交互作用，进行析因分析，结果见表 1。CO2 气腹压力对于人结肠癌 G0/G1 期细胞数值有显著影响(P 0.01)，对于 S 期、G2/M 期无影响，而 CO2 气腹持续作用时间对于各细胞周期无影响(
