《C5位上羟基对染料木黄酮抑制重组人蛋白激酶CK2活性的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《C5位上羟基对染料木黄酮抑制重组人蛋白激酶CK2活性的影响（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1C5 位上羟基对染料木黄酮抑制重组人蛋 白激酶 CK2 活性的影响作者：林小聪，刘新光，李春梅， 陈小文【摘要】 目的 观察染料木黄酮 C5 位上的羟基对其抑制重组人蛋白激酶 CK2 全酶活性的影响。方法 将利用基因工程技术获得的重组人 CK2及 亚基在体外等摩尔混合构成 CK2 全酶。通过测定药物作用后转移到 CK2 底物上的 32PATP 的 32P 的放射性活度，探讨染料木黄酮和大豆甙元对重组人 CK2 全酶活性的抑制作用，并采用半数效量概率单位法计算其 IC50 值。结果 染料木黄酮和大豆甙元能明显抑制重组人 CK2 全酶活性，其 IC50 值分别是 27.95 mol/L 和 2.
2、38 mol/L，作用效果接近或者强于目前已知的 CK2 抑制剂 N (2 氨乙基) 5 氯萘1 硫胺 (A3)。结构效应分析表明：C5 位上的羟基可减弱染料木黄酮对重组人CK2 全酶的抑制作用。结论 染料木黄酮和大豆甙元是两种有效的重组人 CK2 全酶的抑制剂。 【关键词】 蛋白激酶 CK2；全酶；染料木黄酮；IC50【Abstract】 Objective To observed the effects of 5 hydroxyl group of genistein on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme activity.M
3、ethods Recombinant human protein kinase CK2and subunits which were abtained by genetic engineering tecnology were mixed into reconstitute CK2 holoenzyme. the effects of 5 hydroxyl group of genistein on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme activity was study by detecting incorporation of 3
4、2P of 32PATP.Results Genistein and daidzein were shown to inhibit obviously recombinant CK2 holoenzyme activity in a concentration dependent manner with IC50 values of 27.95，2.38 mol/L，respectively，which display a close effect or more potent than previously known inhibitor N (2 aminoethy1) 5 chloron
5、aphthalene 1 sulfonamide (A3). Structure activity study indicated that hydroxyl group at position 5 is detrimental per 2se for the inhibitory effects of genistein on CK2.Conclusion Genistein and daidzein were two effective inhibitors of recombinant human protein kinase CK2 in vitro.【Key words】 prote
6、in kinase CK2; holoenzyme; genistein; IC50 蛋白激酶 CK2 是一种高度保守的第二信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶。全酶是由两个催化亚基( 或 ) 和两个调节亚基()组成的不均一四聚体(22，22 或 2 )1，2。CK2 的 和 基因是原癌基因3。在多种实体瘤细胞和白血病细胞中，CK2 活性比相应的正常组织中高 38 倍4，5。转基因小鼠淋巴细胞中的 CK2 亚基的失控表达可导致淋巴瘤，CK2 亚基与原癌基因 c Myc 共表达或在 p53 表达被改变条件下，CK2 基因的表达可促进急性淋巴细胞性白血病的发生2。此外，CK2 与 HIV 1 的生命周期
7、关系十分密切，它可在 HIV 1 的复制、转录及裂解细胞等功能的调控中起重要作用，一些 CK2 抑制剂具有抗HIV 1 活性6。Sarno 等7指出，CK2 在寻找抗肿瘤及抗病毒药物方面是一个具有吸引力的分子靶点，其特异性抑制剂具有潜在的临床应用价值。黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、利胆、强心、镇痛和抗肿瘤等多种生物学活性并与蛋白激酶关系密切；多种黄酮类化合物能抑制蛋白激酶的活性8。染料木黄酮和大豆甙元作为两种结构非常相似的黄酮类化合物（结构式见图 1），它们可能会影响 CK2 的活性。因此我们选择染料木黄酮和大豆甙元作为研究的对象，在已克隆、表达和纯化人 CK2及 亚基的基础上911，
8、探讨其对重组人蛋白激酶 CK2全酶的抑制作用，并观察 C5 位上的羟基对其抑制作用的影响，为进一步寻找新型的抗肿瘤和抗病毒药物奠定基础。图 1 染料木黄酮和大豆甙元的化学结构（略）3材料与方法1.材料和试剂 染料木黄酮和大豆甙元购自 Aldrich 公司；P81 磷酸纤维素滤纸为 Whatman 公司产品； 32PATP 为北京福瑞生物医学工程公司生产。其余为国产分析纯试剂。2.实验仪器 GB2002 型电子分析天平为 Mettler Toledo 仪器上海有限公司产； LS6000SC 型液闪计数仪为 Beckman 公司产；UV2100 型分光光度计为尤尼柯上海仪器有限公司产。3.克隆、表
9、达和纯化人 CK2和 亚基 人 CK2和 亚基 cDNA 重组质粒pTCKA和 pTCKB 的克隆与测序见我们以前的报道9，10。重组人 CK2和 亚基的原核表达、纯化与鉴定见我们以前的报道9，11。4.体外重组人 CK2 的蛋白定量 按常规的考马斯亮蓝 R 250 染色法，以牛血清白蛋白作为标准12。5.体外重组人 CK2 的活性测定 酶反应总体积为 35 l，反应混合液中含：50 mmol/L Tris HCl，150 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，10 mol/L ATP， 32PATP 1.85104Bq(比活 1.851017Bq/mol)，去磷酸化酪蛋白 2
10、 g/L，pH 7.2。反应温度为 30。将纯化的重组人 CK2与 亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人CK2 全酶。加重组 CK2 全酶 10 l 启动酶反应，反应 10 min 后取 30l 点至直径 2 cm 的 P81 磷酸纤维素滤纸上终止反应，阴干，用 85 mmol/L 磷酸洗涤 8 次，最后用丙酮洗涤 1 次，80烤干后，加闪烁液于液闪仪计数，每组同时做 3 个平行管。6.染料木黄酮和大豆甙元对重组人 CK2 全酶的直接作用及半数抑制浓度4(IC50)的计算 将纯化的重组人 CK2与 亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人 CK2 全酶。在每个反应管中分别加入 10
11、 l 不同浓度的受试化合物，加入 15 l反应混合液，以 10 l 全酶启动反应从而观察受试化合物对 CK2 全酶活性的影响。IC50 的计算根据半数效量概率单位法13进行。以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标，求出直线回归方程，并根据方程计算 IC50值(50%抑制时的概率单位为 5)。7.统计学处理 以 SPSS 11.0 软件做统计学数据处理，实验结果用- s 表示，多组资料采用 one way ANOVA 分析，组间的比较用 Dunnetts t 检验。结果1.染料木黄酮和大豆甙元对重组人 CK2 全酶的直接作用 将纯化的重组人CK2与 亚基按等摩尔(
12、14 pmol)混合构成重组人 CK2 全酶，以 2 g/L 去磷酸化酪蛋白作为底物，向反应体系中分别加入不同浓度的染料木黄酮和大豆甙元测定CK2 的活性。实验结果表明，染料木黄酮和大豆甙对 CK2 有较明显的抑制作用，且随着浓度的不断增加其对 CK2 全酶的抑制率逐渐上升，呈现浓度依赖性关系（见表 1 和表 2）。表 1 染料木黄酮对重组人蛋白激酶 CK2 全酶活性的影响（略）注：与 0 mol/L 组比较，bP0.01，cP0.01表 2 大豆甙元对重组人蛋白激酶 CK2 全酶活性的影响（略）注：与 0 mol/L 组比较，cP0.0152.染料木黄酮和大豆甙元对重组人 CK2 全酶直接作
13、用的半数抑制浓度(IC50) 根据染料木黄酮和大豆甙元对重组人 CK2 活性抑制作用的结果，以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标（见图 2 和图 3），求出直线回归方程分别为：Y=1.509X1.7227，r2=0.9924 （染料木黄酮）；Y=0.3402X+3.9237， r2=0.9902（大豆甙元）。根据 50%抑制率时概率单位为 5，利用回归方程计算相应的结果分别为 27.95mol/L 和 2.38 mol/L。由此可见，大豆甙元对重组人 CK2 全酶活性的抑制效果要强于染料木黄酮。图 2 半数效量概率单位法分析染料木黄酮对重组人 CK2 全酶抑制
14、作用的IC50 值（略）图 3 半数效量概率单位法分析大豆甙元对重组人 CK2 全酶抑制作用的 IC50值（略）讨论蛋白激酶 CK2 是一种多功能的丝/苏氨酸蛋白激酶。有学者指出，CK2 可能是肿瘤和艾滋病治疗的分子靶点之一，其特异性抑制剂具有潜在的临床治疗价值7，14。CK2 又是一种多底物的蛋白激酶，迄今已发现其有 300 多种底物。CK2的许多底物如蛋白激酶 A(PKA)、P34cdc2、P53、糖原合酶、钙调蛋白、乙酰 COA羧化酶、雌激素受体 2、热激蛋白 90(HSP90)、酪蛋白磷酸酶 1B 以及胰岛素受体底物 1（IRS 1）等参与信号转导途径4。其中，钙调蛋白、p34cdc2
15、 和雌激素受体 2，既可受 PKC 调节，又是 CK2 的重要底物4，15。此外，细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)以及糖原合酶激酶 3(GSK 3)等6多种细胞代谢调节激酶的催化亚基与 CK2 的 和 亚基具有高度的同源性15。这些揭示了某些信号转导、细胞代谢调节的激酶与 CK2 之间存在密切的相互关系，因此这些激酶的抑制剂均可作为 CK2 抑制剂的筛选化合物。 由于CK2 在细胞内的含量较低，而且从组织中提取纯化较为困难，因此我们通过基因工程方法获得大量有生物学活性的重组人 CK2911，然后将纯化的重组人CK2与 亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组
16、人 CK2 全酶。全酶的性质鉴定表明重组人 CK2 全酶具有与天然 CK2 一致的性质，如可以酪蛋白作底物；而用碱性蛋白组蛋白S 和 TPK 的底物 Poly(Glu：Tyr)41 作底物时，CK2 的活性则很低。另外，重组人 CK2 全酶的活性受到肝素和 CK2 特异性抑制剂 DRB 的抑制，精胺则有激活作用；而一些第二信使分子，如 cAMP、cGMP 和 Ca2+则对 CK2 的活性基本没有影响16。我们以此作为基础来研究染料木黄酮和大豆甙元对重组人CK2 全酶活性的影响。N (2 氨乙基) 5 氯萘 1 硫胺(A3)是目前公认的对 CK2 有抑制作用的化合物1，4，我们以前的研究表明17， A3 对重组人 CK2 全酶有较强的抑制作用，其 IC50 值为 25
