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1、1ICAM1 在实验性自身免疫性脑脊髓炎 发病机制中的作用作者：赵亚朴 王红 刘慧敏 王秀卿 黄庆军【摘要】 目的 检测实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠血脑屏障中血管内皮细胞细胞间粘附分子1(ICAM1)的表达，并分析其表达与 EAE 发病的关系。方法 取 EAE 组和对照组大鼠的脑组织，石蜡切片，免疫组化染色，图像扫描系统观测，图像分析软件进行灰度分析。结果 EAE 组大鼠脑血管内皮细胞上 ICAM1 的表达明显深于对照组。实验组的灰度值为 141.476.88，而对照组为 166.247.24，两组差异非常显著(P0.01)。结论 大鼠 EAE 时脑血管内皮细胞 ICAM1 的表达上
2、调，提示 ICAM1 是与 EAE 发生相关的重要粘附分子。 【关键词】 免疫组织化学法； ICAM1； 血脑屏障； 实验性自身免疫性脑脊髓炎【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of ICAM1 in the bloodbrain barrier and the experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE). Methods Brain of EAE as well as control animals were taken and
3、 embedded in paraffin.And the sections were stained by immunohistochemical method. Then the sections were observed by Nikon image scanning system and measured the gray value by IPP image analysis software. Results The expression of ICAM1 in the epithelial cell of endangium of EAE rats brain was high
4、er than that in control. Conclusion The increase of the expression of ICAM1 in the epithelial cell of endangium of EAE rats brain indicated that ICAM1 was a necessary adhesion molecule in the developmental process of EAE.【Key words】 Immunohistochemical method；Intercellular adhesion molecular1；Bloodb
5、rain barrier；Experimental autoimmune encephalomyelitis多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)可能是一种与遗传、病毒感染、地理环境等2诸多因素有关的自身免疫性疾病1。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)与 MS 在临床、生化、免疫及病理等诸多方面具有相同的特征，因此成为深入研究 MS 的理想动物模型。在免疫学的研究中，粘附分子在 EAE 发病中的作用越来越受到关注。那么，血管内皮细胞细胞间粘附分子1(intercellular adhesio
6、n molecular1，ICAM1)在血脑屏障中的表达是否与EAE 的发生有关？本研究采用免疫组化法检测了 ICAM1 在血脑屏障中的表达，以探讨其与 EAE 发病的关系。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物及分组 雌性 Wistar 大鼠 50 只，810 周龄，体重(19210)g，随机分为实验组(免疫抗原组)和对照组(完全弗氏佐剂/百日咳杆菌组)。实验组注射牛髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)+完全弗氏佐剂(Freunds adjuvant complete，CFA)+百日咳杆菌；对照组注射生理盐水+CFA+百日咳杆菌，每组各 25只。1.1.2
7、 试剂 ICAM1 羊抗鼠 IgG 多抗(Santa Cruz)、SP 通用型试剂盒(ZYMED)。1.2 方法1.2.1 制备动物模型 MBP 提取方法与动物模型制备方法沿用我们以往建立的方法2。EAE 的严重程度依据 Kono 等3的标准评定。1.2.2 免疫组化法检测血脑屏障 ICAM1 的表达 取发病高峰期的 EAE 大鼠和对照组大鼠各 7 只，剥取大鼠的小脑，福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，每隔5 张取 2 张，每份标本选出 6 张切片。使用 ZYMED 公司 SP 试剂盒，采用三步法3进行免疫组化染色。用 Nikon 图像扫描系统进行观测。采用美国 IPP 图像分析软件进行灰度分
8、析。每只大鼠取 12 张片子，沿矩形路线观测。1.2.3 统计学方法 数据资料用 SPSS 11.0 统计软件包进行处理，采用两组间均数比较的独立样本 t 检验(双侧)进行统计学分析。2 结果2.1 发病情况与体重变化 实验组 25 只大鼠全部发病，起病时间为(10.741.19)d，评分在 1 分以上者达 100%，评分在 4 分以上者达 45%，病死率 12%。依照Kono 等的评分标准，平均得分为(3.540.75)分。从注射抗原后 0 天到第 15 天，平均体重减轻(28.616.6)g；而对照组 25 只大鼠无一发病，体重随鼠龄的增大而持续增长，至注射后第 15 天，平均体重增长(1
9、4.25.1)g。2.2 脑、脊髓组织的病理改变 取发病高峰期 EAE 大鼠和对照组大鼠的脑和脊髓，石蜡切片，常规 HE 染色，光镜下可见 EAE 大鼠的脑和脊髓组织中有大量炎性细胞浸润(主要是淋巴细胞和单核细胞)，炎性细胞主要聚集在血管周围，形成典型的“袖套”样改变46，而对照组大鼠脑和脊髓组织未见炎性细胞浸润和神经细胞的变性、坏死。2.3 免疫组化法检测血脑屏障血管内皮细胞 ICAM1 的表达 镜下观察发现EAE 组大鼠脑血管内皮细胞上 ICAM1 的染色明显深于对照组，血管内皮细胞阳性反应呈明显的棕黄色。尤其在脉络丛的血管内皮细胞处阳性反应更为明显。运用计算机图像分析系统进行分析，测量
10、ICAM1 的灰度值(灰度值是反映透光密度的定量指标，它与 ICAM1 表达的量呈负相关，即灰度值越高，表示4ICAM1 蛋白表达量越少；而灰度值越低，则表示蛋白表达量越多)7。从统计结果可见实验组的灰度值为 141.476.88，而对照组为 166.247.24，两组比较，差异有非常显著的统计学意义(P0.01)。 3 讨论EAE 的病理特征之一是在脑白质部位小血管周围产生以 T 细胞为主的炎细胞浸润、水肿、脱髓鞘等病理改变。而血脑屏障是一种存在于血液循环与脑组织之间的屏障结构，主要由毛细血管内皮细胞组成。正常情况下，蛋白质一类大分子物质不能通过血脑屏障，甚至一些极性小分子也只能缓慢地进入脑
11、内8。因此，在健康动物 CNS 内很难检测出 T 细胞及单核巨噬细胞。在本实验中，发病动物的 CNS中可见到大量 T 细胞，说明 T 细胞通过某种机制穿越了血脑屏障而进入 CNS 造成炎症损伤。炎症过程一般为白细胞穿越血管内皮细胞，向炎症部位迁移。血管内皮细胞上粘附分子的表达是白细胞与血管内皮细胞粘附过程的一个重要分子基础。在此粘附过程中，首先是选择素分子介导的淋巴细胞与血管内皮细胞的不稳定粘附，随后血管内皮细胞膜结合的细胞因子作用于淋巴细胞，并激活其表面的整合素分子，导致加强粘附及穿越血管内皮细胞的过程。粘附分子 ICAM1 广泛分布在体内的造血和非造血细胞上。ICAM1 在血管内皮细胞上也
12、有一定数量的表达，它参与白细胞穿越毛细血管壁到达炎症部位的过程。ICAM1 在血管内皮细胞上的表达受一些因素的影响，如：炎症介质能明显上调内皮细胞和其他非造血细胞ICAM1 的表达9,10。据 Steffen 等11报道，在正常 CNS 的微血管内皮细胞中可检测到少量表达的 ICAM1，正常脑室脉络丛上皮细胞可表达 ICAM1。即正常情况下，ICAM1 可以在血管内皮细胞有低水平的表达。5本组实验发现，无论是对照组大鼠还是实验组大鼠，其脑组织血管内皮细胞中均可观测到 ICAM1。不同的是 EAE 大鼠 ICAM1 的表达显著高于对照组, 提示ICAM1 是与 EAE 发生相关的重要的粘附分子，
13、同时，ICAM1 的表达在炎性细胞因子如 TNF、IFN 等刺激下明显增高。而本研究小组在系列研究中发现，TNF、IFN 在 EAE 模型增高，与本组研究结果相一致。提示 TNF 和IFN 在 EAE 发生中的致病作用可能是通过增加 ICAM1 在脑组织血管内皮细胞的表达, 进而介导 T 细胞和其他炎性细胞穿越血脑屏障来实现的。对 ICAM1 的检测表明，EAE 中粘附分子表达的上调与 EAE 的发生密切相关。可以设想，通过封闭粘附分子，减少或阻止白细胞介导的组织损伤有可能成为未来预防或治疗 EAE 极有前途的方式之一。【参考文献】1 Braunwald F, Kasper H, Longo
14、J,et al.哈里森内科学.人民卫生出版社,2003.30263030.2 赵亚朴,黄庆军,魏林,等.牛脊髓髓鞘碱性蛋白的提取及初步鉴定.中风与神经疾病杂志,2006，23(3)：315317.3 Kono DH,Urban JL,Horvath SJ,et al.Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice.J Exp Med.1998,168(1):213227.4 董梅,刘瑞春,郭力,等.Wistar 大鼠多病程实验性
15、变态反应性脑脊髓炎的模型建立.中国免疫学杂志，2006，22(1):7881.5 刘学彬,冯璞,谢蜀生. 髓鞘碱性蛋白的提取鉴定及其诱导的口服耐受.北京医科6大学学报,1998，30(4)：320322.6 余昌胤,郑和忠,范瑞明.大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎 CD4+,CD8+的改变及意义.中国临床康复,2006,10(34):7677.7 沈强,刘亚敏,张赐安. 麝香、冰片对全脑缺血再灌注大鼠脑微血管内皮细胞ICAM1 表达的影响. 中西医结合心脑血管病杂志,2003,1(3):136138.8 Briscoe DM, Cotran RS, Pober JS. Effects of tum
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