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1、1hTERC 基因扩增与宫颈病变的相关性研 究【摘要】 目的：探讨人端粒酶基因( human telomerase gene, hTERC)基因扩增与子宫颈癌发生及发展的关系。方法：收集 100 例宫颈细胞涂片根据细胞形态学检查结果将涂片分类，应用荧光原位杂交技术(FISH)技术对分类不同的涂片进行 hTERC基因的检测，以探索 hTERC 基因扩增与不同细胞形态学改变的关系。结果：通过100 例标本的检测发现，正常或炎症组 26 例，出现基因扩增 5 例，扩增率为 19.25 %;CIN组检测 37 例，8 例扩增，扩增率为 21.6 %;CIN组检测 23 例，14 例扩增，扩增率为 60
2、.8 %;CIN组检测 12 例，9 例出现扩增，扩增率为 75.0 %;宫颈癌 2例均扩增。结论：hTERC 基因高表达在子宫颈癌发生、发展中可能起重要作用，在子宫颈病变脱落细胞中检测 hTERC 扩增可以帮助确定低分化病变的高风险，可以作为子宫颈癌早期筛查、病情监测和评估预后的辅助指标。 【关键词】 FISH 技术;hTERC 基因;宫颈病变在世界范围内，宫颈癌仍然是严重威胁妇女健康的主要恶性肿瘤之一。发病率居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位，每年全世界大约有 49.3 万的新发病例，在中国每年有约 12 万新发病例1。宫颈癌的发生和发展是一个多基因、多因素、由渐变到突变的过程。近年有研究表明
3、宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变过程中几乎都伴有 3 号染色体长臂扩增,其中涉及到最重要的基因是 hTERC2, hTERC 基因定位在 3q26.3。本研究采用 FISH 方法检测不同程度子宫颈病变脱落细胞中 hTERC 基因的表达，探讨 hTERC 基因高表达在子宫颈癌发生、发展中可能起的重要作用，以及对于预测子宫颈病变的进展和不良预后的意义，为临床子2宫颈癌的筛查、诊断提供实验依据。1 材料与方法1.1 研究对象 收集内蒙妇幼保健院 2008 年 4 月至 2008 年 12 月宫颈门诊和住院患者的子宫颈脱落细胞 100 例，其中 CIN37 例、CIN23 例、CIN 12 例、
4、浸润性子宫颈癌初诊患者 2 例，所有病例均未接受任何治疗。26 例正常或炎症子宫颈脱落细胞取自常规体检妇女，临床检查无异常，脱落细胞学检查阴性;病变标本均有病理检查证实。1.2 细胞标本 用液基薄层细胞学宫颈刷插入宫颈口, 在宫颈外口鳞柱状上皮交界处, 以宫颈外口为中心, 均匀旋转 35 周, 取出宫颈刷放入 TCT 小瓶里，待 TCT 涂片后的剩余液体移入 15 mL 离心管里 1 000 rpm 离心 5 min 弃上清，收获宫颈脱落细胞。1.3 主要试剂 所用 FISH 探针由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供TERC/CSP3 DNA 双色探针。hTERC 基因标记在 3q26.3 位点,
5、 CSP3 DNA 标记在3 号染色体着丝粒处(3p11-q11), 分别用红色(Rhodamine) 和绿色( FITC) 标记,以CSP3 探针作为对照。1.4 研究方法1.4.1 样本玻片预处理 取 510 mL 采集的细胞样本在 1 000 rpm 下离心 10 min 后，弃上清。加入 5 mL 胶原酶 B，置于 37 水浴 20 min。离心后弃上清。加 5 mL 去离子水置 37 水浴 40 min，卡诺固定液(甲醇冰醋酸=31)固定 3 次。滴片，56 老化 30 min。1.4.2 标本变性及杂交 玻片在 2SSC 中漂洗 2 次。室温下于 0.1 M HCl 溶液3中浸泡玻
6、片 10 min。2SSC 中漂洗 2 次。20 mg/mL 胃蛋白酶溶液消化 10 min，2SSC 漂洗 2 次，依次置于-20 预冷的 70 %、85 %、100 %乙醇进行梯度脱水，自然干燥后，将玻片在预热的变性液(70 %甲酰胺/2SSC)中浸泡 5 min。依次置于-20 预冷的 70 %、85 %、100 %乙醇进行梯度脱水。自然干燥后，置 4550 烤片机上预热 25 min 后与探针杂交。1.4.3 标本杂交 将探针混合物置于 731 水浴箱中变性 5 min 后，将混合物置于 4550 水浴箱 20 min,杂交前取出。将 10 L 变性后的探针混合物滴于玻片杂交区，立即加
7、盖盖玻片(20 mm20 mm)，用封片胶封边。玻片置于预热的湿盒中，42 保温箱中过夜杂交。1.4.4 玻片洗涤 移去盖玻片，立即将玻片置于盛有 50 %甲酰胺/2SSC 溶液中洗涤 3 次，在 2SSC 溶液洗涤一次，在 2SSC/0.1 %NP-40 洗液洗涤，将玻片室温浸泡在 70 %酒精 3 min。 1.4.5 观察及结果判定 暗处自然干燥玻片。将 15 L DAPI 复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置 1020 min 后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片。单个间期细胞核中红色及绿色信号各 2 个为正常细胞。单个间期细胞核中红色信号大于 2 个，绿色信号不
8、少于 2 个为 hTERC 基因扩增异常细胞。计数 200 个细胞，异常细胞比例大于阈值，表示发生了 hTERC 基因扩增。1.4.6 统计学分析 用 SPSS 1310 软件进行统计学 2 检验, P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果4随着子宫颈脱落细胞病变的进展, hTERC 基因阳性表达率逐渐增高。hTERC基因表达在 CIN和 CIN组与正常对照组比较差异有统计学意义(P0.05)，子宫颈癌组与 CIN 各组及正常对照组中 hTERC 基因表达比较差异有统计学意义(P0.05)，见表 1。表 1 5 组样本 hTERC 基因检测结果3 讨论端粒酶是由 RNA 和蛋白质亚基组成的核
9、糖核蛋白复合物,以自身 RNA 组分为模板、蛋白质组分为具有催化活性的逆转录酶，合成端粒重复序列，维持端粒长度，绝大多数正常的体细胞和组织端粒酶均为阴性，端粒酶的激活与细胞的无限增殖有关，大量研究结果表明，端粒酶活化是许多肿瘤发生的必经之路，端粒酶的激活可能是宫颈癌发生的早期事件3，因此端粒酶可以作为宫颈癌及癌前病变的有效标志物。hTERC 基因是人端粒酶的主要组分之一, hTERC 基因的突变将导致端粒酶功能改变,从而出现染色体异常,引起肿瘤发生。宫颈癌的发生发展几乎都伴有hTERC 基因的扩增。本文应用 FISH 技术对宫颈癌和癌前病变宫颈涂片进行了分子水平的检测。研究表明, 随着宫颈病变
10、的进展, hTERC 基因的异常表达率和基因拷贝数逐渐增加,基因异常扩增阳性率在 CIN以上病变组明显高于 CIN及以下组。并显示随病变级别增高,浸润癌组与 CIN 组相比, hTERC 基因拷贝数明显增加。在杂交信号类型中,hTERC 基因高拷贝型率随病变级别增高比例明显增高,并且通过随访发现病变发生高级别进展组的 hTERC 基因拷贝数明显高于未进展组,可能与在病变发展过程中非整倍体的增加以及染色体不稳定增加有关,其中3q 染色体不稳定增加可能是发生宫颈癌变的因素之一。5TERC 扩增可以预测从 CIN、CIN到 CIN 和浸润癌进展, 这与 Kerstin等的研究一致。因此，TERC 基
11、因是宫颈癌重要的肿瘤标志物,检测 TERC 扩增可以帮助确定 CIN 分级及预测低分化病变演变的高风险。通过对 TERC 基因的检测可以在癌前病变时发现和治疗, 达到预防宫颈癌的目的4。另外, TERC 的扩增对癌前病变的转归可能有预测价值，其确切的结论需做进一步的追踪调查和研究。【参考文献】1 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer atistics,2002J . CA Cancer J Clin， 2005,55(2):74-108.2 Andersson S, Wallin KL, Hellstrm AC, et al.Fre
12、quent gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 in cervical adenocarcinomasJ. British Journal of Cancer, 2006, 95(3):331.3 Oikonomou P, Mademtzis I, Messinis I, et al. Quantitative determination of human telomerase reverset ranscriptase mes2 senger RNA expression in premalignant cervical lesions and correlation with human papillomavirus load J. Hum Pathol,2006,37(2):35-142.4 彭玉池，凌斌，周颖.子宫颈病变脱落细胞中端粒酶的表达及临床意义J.实用癌症杂志，2008，23(6)：574-576.
