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1、1HPLC 法测定甲肿消及大鼠血清中土贝母 苷甲的含量作者：崔翰明,程慧平,刘喜明,朱晓芸【摘要】 目的 建立甲肿消制剂及灌胃给予甲肿消后大鼠血清中土贝母苷甲的含量测定方法。方法 采用 RP-HPLC 法,甲肿消制剂用甲醇萃取,血清样品采用 C18SPE固相萃取柱(3 mL,200 mg,60 m)处理,甲醇洗脱；色谱柱：Diamonsil C18(250 mm4.6 mm,5 m)和 Easyguard 保护柱；流动相：甲醇-水(6535),检测波长：214 nm,流速：1 mL/min。结果 甲肿消制剂及大鼠血清中土贝母苷甲的回收率分别为(103.493.49)%、(104.704.69)
2、%,土贝母苷甲在 1.1888.5 g/mL 浓度范围内线性良好。每 1 g 制剂含土贝母苷甲 995.3 g,灌胃给予甲肿消后大鼠血清中土贝母苷甲浓度为 3.19 g/mL。结论 本方法快速、简便、准确,可用于测定制剂及其血清中土贝母苷甲的含量。 【关键词】 甲肿消；土贝母苷甲；固相萃取；反相高效液相色谱法；含药血清；含量测定Key words：Jiazhongxiao；Tubeimoside ；SPE；RP-HPLC；drug containing serum；determination甲肿消处方由夏枯草、土贝母等组成,按适当工艺制成浓度为 3 g/mL 原药材的浸膏剂。动物和临床试验证明
3、,该制剂具有较好的化痰散结、治疗甲状腺功能亢进型甲状腺肿大的作用。但其作用途径与机理尚不清楚,故我们采用血清药理学的方法,观察本制剂大鼠灌胃给药后的含药血清对甲状腺细胞增殖的影响,以阐明本方治疗甲状腺功能亢进的机理。土贝母为葫芦科植物土贝母Bolbostemma paniculatum 2(Maxim.) Franquet的干燥块茎,有散结、消肿、解毒之功效。从中分离出的土贝母苷甲是其主要有效成分,具有抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等多种活性1。因此,我们采用 RP-HPLC 法建立了大鼠含药血清中的代表性成分土贝母苷甲(土贝母)的含量测定方法,为进一步阐明本方治疗甲状腺功能亢进的机理提供分析方法。
4、1 仪器与试药LC-10A 高效液相色谱仪和 SPD-10A 紫外检测器(日本导津公司)；XW-80A 涡旋混合器；PHS-25 型酸度计；TGL-16 g 台式高速离心机；ME215P 型分析天平(Sartorius)；Diamonsil C18 分析柱(250 mm4.6 mm,5 m)；Easyguard 保护柱(迪马公司)；固相萃取小柱(C18SPE,200 mg,3 mL,瓦里安公司)。体重(33010)g 的雄性Wister 大鼠(中国医学科学院动物中心,合格证号：SCXK-2005- 0013)。夏枯草、土贝母等药材购自燕京饮片厂,由本院药理实验室鉴定,符合 2005 版中华人民
5、共和国药典标准；土贝母苷甲(批号 1536-200001)对照品由中国药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈等试剂均为色谱用；水为高纯水。2 方法与结果2.1 含药血清的制备2.1.1 甲肿消制剂的制备按处方量配制,水煎煮提取,过滤,滤液减压浓缩后得浓度为每毫升相当于 3 g原药材的浸膏剂。2.1.2 大鼠含药血清的制备3选取体重(33010)g 的雄性 Wistar 大鼠 30 只,其中 20 只按体重 5 mL/kg 的剂量灌胃给予甲肿消浸膏剂,10 只按体重给予同剂量生理盐水,每天 2 次,连续 7 d。末次灌胃后开始计时,于 60 min 后,用玻璃毛细管自乙醚麻醉大鼠眼底采血,收集血样于
6、离心试管中,放置 2 h 促凝, 1 500 r/min 离心 10 min,吸取上清液,0.22 m 滤膜过滤,滤液即为含药血清和空白血清,-20 冷冻保存。2.2 甲肿消和大鼠含药血清中土贝母苷甲的含量测定2.2.1 甲肿消样品的前处理精密称取甲肿消浸膏约 3 g,分别用甲醇(15、15、10 mL)超声(300 W,55 kHz)提取 3 次,每次 5 min,0.45 m 滤膜过滤,合并滤液,加甲醇定容至 50 mL。精密量取 10 mL,减压除去溶剂,残渣精密加入甲醇 2 mL,超声溶解,0.45 m 滤膜过滤,取续滤液作为含量测试试液。2.2.2 血清样品中土贝母苷甲的前处理冻存血
7、清于室温解冻备用。选取 C18SPE 柱(200 mg,3 mL,60 m),先用 2 mL 甲醇冲洗,再用 2 mL 纯水冲洗活化；精密量取血清 1 mL 上样,弃去流出液,用 2 mL纯水冲洗,再用 1 mL 甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液作为供试液。2.2.3 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18(250 mm4.6 mm, 5 m)和 Easyguard 保护柱；流动相：甲醇-水(6535)；流速：1 mL/min；检测波长：214 nm；进样 10 L。色谱图见图 1。 42.2.4 标准曲线的测定精密称取土贝母苷甲标准品 11.8 mg,用 65%甲醇配成浓度为 118 g/mL
8、的标准溶液,然后分别用 65%甲醇稀释制成土贝母苷甲浓度为14.75、29.5、59、88.5、118 g/mL,按“2.2.3”项色谱条件测定。以土贝母苷甲的峰面积 A 和浓度 C 作图,进行线形回归,得标准曲线方程：A2 503.1C2 300.5,R20.999 6,土贝母苷甲在 14.75118 g/mL 的浓度范围内线性良好。取土贝母苷甲浓度为 118 g/mL 的标准溶液,分别精密量取一定量,加入空白血清,使土贝母苷甲浓度为 1.18、2.36、11.8、14.75、29.5、59、88.5 g/mL,按“2.2.2”和“2.2.3”项操作,记录土贝母苷甲的峰面积。以峰面积 A 和
9、浓度 C 作图,进行线形回归,得标准曲线方程：A2 458.2C2 127.8,R20.999 3,血清样品中土贝母苷甲在 1.1888.5 g/mL 的浓度范围内线性良好。2.2.5 精密度和回收率测定取土贝母苷甲浓度为 59 g/mL 的标准溶液,按“2.2.3”项色谱条件测定 3 次。将峰面积代入标准曲线方程,计算土贝母苷甲的浓度为(59.402.00)g/mL,与配制浓度比较,计算精密度,RSD3.39%。取土贝母苷甲标准溶液加入空白制剂中,制成浓度为 59 g/mL 的样品溶液,分别按“2.2.1”和“2.2.3”项操作,测定 3 次。将峰面积代入标准曲线方程,计算土贝母苷甲的浓度,
10、计算回收率为(103.493.49)%。取土贝母苷甲标准溶液加入空白血清中,制成浓度为 29.5 g/mL 的血清样品溶液,按5“2.2.2”和“2.2.3”项操作,记录土贝母苷甲的峰面积。将峰面积代入标准曲线方程计算浓度,与配制浓度比较,平均回收率为(104.704.69)%(n3)。2.2.6 甲肿消和大鼠血清样品中土贝母苷甲含量的测定精密称取甲肿消浸膏 3.086 g,按“2.2.1”和“2.2.3”项操作；精密量取灌胃给予甲肿消后的大鼠血清 1 mL,按“2.2.2”和“2.2.3”项操作。分别记录土贝母苷甲的峰面积。将峰面积代入标准曲线方程计算浓度,每克制剂含土贝母苷甲 995.3
11、g,灌胃给予甲肿消后大鼠血清中土贝母苷甲浓度为 3.19 g/mL。3 讨论制备含药血清过程中所用器具应热压灭菌,试验中应采用无菌操作方法,血样不可使用肝素等抗凝剂,静置约 1 h 等血液自然凝固后离心,可得到含药血清1。试验中考察了氯仿、甲醇和无水乙醇等提取溶剂和提取方法,发现以甲醇为提取溶剂,采用超声方法提取率高,杂质干扰少2。由于大鼠血清中土贝母苷甲含量很低,采用常规萃取方法难于定量,回收率也不高。因此,试验中采用固相萃取法处理血清样品,经优化后选取 C18SPE 柱(200 mg,3 mL,60 m)血清样品直接上样,纯水冲洗杂质,甲醇洗脱,经精密度和回收率试验证明本方法快速、简便、准确,可用于测定血清中土贝母苷甲的含量。【参考文献】1 宋 珏,路 通,谢 林,等.以血清药理学方法研究黄连解毒汤对小鼠的药效动力学J.中草药,2005,36(5)：709713.2 魏有良,杨小梅,徐长根,等.HPLC 法测定土贝母中土贝母苷甲含量J.西北6药学杂志,2000,15(3)：107108.
