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1、1 分泌酶原核表达载体的构建、表达及 融合蛋白纯化作者：朱爱华 李敬 陆军 钱进 郑元林【摘要】 目的 构建小鼠 分泌酶原核表达载体并诱导其表达和纯化，为进一步研究 分泌酶的作用奠定基础。方法 根据基因文库中小鼠 分泌酶基因的 cDNA序列设计引物，采用 RT PCR 方法扩增到 分泌酶的 cDNA 片段，克隆进原核表达载体 pET 28a 中，并转化大肠杆菌 BL21(DE3)，测序鉴定后，通过 IPTG 诱导表达出目的蛋白，经亲合层析纯化。结果 从小鼠的脑组织 RNA 中扩增出特异的 分泌酶基因片段长 1 506 bp，经酶切鉴定及 DNA 序列测定，证实重组载体pET28a BACE 构
2、建正确，表达融合蛋白分子量约为 55 kD，经镍离子亲合柱层析纯化获得电泳级纯度的目的蛋白。结论 在大肠杆菌中获得了小鼠 分泌酶的高效表达，为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。 【关键词】 分泌酶；大肠杆菌；表达；融合蛋白【Abstract】Objective To build mice secretase prokaryotic expression vector and induce its expression and purification, to afford basis for secretase research. Methods Primer was designed
3、by mice secretase gene cDNA in Genbank. cDNA segment of secretase gene was amplified by RT PCR, then cloned into prokaryotic expression vector pET 28a and transformed into E. coli BL21(DE3). After sequenced and identified, fusion protein was induced, expressed and purified.Results Special secretase
4、gene segment amplified from RNA of mice brain tissue was 1 506 bp. After identified and sequenced, recombinant vector was proved correct, its fusion protein had a molecular weight of 55 kD. Electrophoresis purity target protein could be acquired. Conclusions Mice secretase has a high expression in E
5、. coli, which build a basis for research of secretases biological function and its application.【Key words】secretase; E. coli; Expression; Fusion protein2阿尔茨海默病(AD)是发病率最高，危害最大的中枢神经系统退变性疾病1。淀粉样斑块是其主要病理特征之一，主要成分 淀粉样蛋白(A)在 AD 的发生、发展中起着重要作用，因此阻断或延迟 AD 早期 A 的积聚成为治疗 AD 的切入点。 分泌酶(BACE)是淀粉样前体蛋白(APP)水解产生 A 的关
6、键酶，是干预 AD进程的理想靶点2。通过酵母或昆虫表达系统表达活性 BACE 在最近已见报道。然而，由于上述系统表达的蛋白量低，不适合 BACE 抑制剂的大规模筛选3，4。而 BACE 的原核表达可克服以上缺陷，为筛选特异性抑制剂及研究 BACE 结构与功能关系提供大量材料，为最终从根本上治疗 AD 带来希望。本研究利用大肠杆菌表达系统，选用 pET 28a 作为表达载体获得小鼠 BACE，经镍离子固定金属亲和层析纯化目的蛋白，以便进一步研究其功能。1 材料与方法1.1 主要材料2 月龄昆明小鼠(购自徐州医学院)；宿主菌 E.coli BL21(DE3)(由本实验室保存)；质粒 pET28a(
7、购自 Novagen 公司)；限制性核酸内切酶 EcoR、BamH、T4 DNA连接酶等工具酶(购自大连宝生物工程公司)；Trizol 试剂及 AMV 逆转录酶(美国Promega 公司)；Pfu DNA 聚合酶及溶菌酶(上海生工生物工程公司)；PCR 纯化和胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)；DNA marker、中分子量蛋白质 marker是 Fermentas 公司产品；镍离子亲合层析柱(Novagen 公司产品)；其他化学试剂均为分析纯。1.2 寡核苷引物的设计与合成3根据基因文库中小鼠 BACE 基因的 cDNA 序列及相应的限制性核酸内切酶位点设计合成 2 条引物 P1:5
8、TAGGATCCATGGCCCCAGCGCTGCACT 3(划线部分为 BamH酶切位点)；P2:5 CGGAATTCTTACTTGAGCAGGGAGATGTCA 3(划线部分为 EcoR酶切位点)。 由上海生工生物工程公司合成。1.3 RT PCR迅速分离小鼠的大脑皮层组织，Trizol 试剂提取总 RNA，反转录后得到cDNA，以 P1 和 P2 做为上、下游引物，设置 PCR 参数：为 94 5 min；94 30 s, 55 45 s, 72 90 s,循环 30 次, 72 10 min,扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行分析,观察片段大小，并纯化 PCR 产物。1.4 重组表达载体
9、的构建将纯化的 PCR 产物经 BamH和 EcoR双酶切后克隆进入经同样双酶切的pET28a 质粒中，获得 pET28a BACE 重组质粒，并转化 DE3 感受态细胞，筛选、鉴定阳性克隆。1.5 融合蛋白的诱导表达挑取含有质粒 pET28a BACE 的 DE3 一单菌落，接种于 50 ml 含有 50 g/ml卡那霉素的液体 LB 培养基中，37恒温振荡培养过夜，按 1%的接种量接种到新鲜的含 50 g/ml 卡那霉素的液体 LB 培养基中，37振荡培养。通过不同的诱导时间和异丙基 D 硫代半乳糖苷(IPTG)浓度优化其表达条件，12% SDS PAGE 检测目的蛋白的表达。在扩大培养至
10、 A600 0.40.6 时加 IPTG 使终4浓度 1 mmol/L，诱导表达 5 h 后收集菌体。1.6 融合蛋白的亲合纯化离心收集诱导后的菌体，溶菌酶裂解后，离心，上清和沉淀分别取样，12% SDS PAGE 检测，确定目的蛋白所在部位。镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白，纯化后可得到经 SDS PAGE 电泳检测，考马斯亮蓝染色单一条带的蛋白。 2 结果2.1 RT PCR 扩增结果将设计合成的引物，以逆转录合成的小鼠脑组织 cDNA 为模板,经 PCR 扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在 1500 bp 左右的有一明显的 DNA 条带(图 1)，与预期大小 1 506 bp 相符。2.2
11、 重组表达载体的鉴定获得的重组质粒进行酶切鉴定，产生预期大小的片段，见图 2。通过 DNA 测序进一步确定成功构建了重组表达载体 pET28a BACE，目的基因序列正确。2.3 重组蛋白的表达含重组质粒 pET28a BACE 的 DE3 经 IPTG 诱导后 1 h 出现新的蛋白质，就有融合蛋白的表达(图 3)。随着培养时间的延长，融合蛋白的表达量随之增加。但到 4 h 后融合蛋白的表达达到高峰并处于稳定水平，随着诱导时间的增加没有明显变化。因此，在大规模发酵培养的时候，诱导后继续培养 5 h 左右就可收获菌体。通过 SDS PAGE 电泳结果还证实，诱导剂加入 4 h 后，融合蛋白的表达
12、约占细菌5总蛋白的 30%左右。表明这一新的融合表达载体能以较高水平表达融合蛋白。2.4 目的蛋白的纯化pET 表达载体中 His tag 可以使融合蛋白利用亲合层析的方法进行分离纯化，将样品处理后和预先处理好的镍凝胶柱结合，经过 10、20、100 mmol/L 咪唑的逐步洗脱，最后得到电泳纯目的蛋白(图 4) ，分子量 55 kD 左右，与理论值相符。3 讨 论本实验选用带有 His tag 标签的 pET 28a 作为 BACE 基因融合表达的载体。主要因为：一是该表达系统中的大肠杆菌菌株 BL(DE3)补充了大肠杆菌缺乏的 6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CC
13、C, GGA)对应的 tRNA,能够提高外源基因,尤其是真核基因在原核表达系统中的表达水平；二是构建表达载体的时候将 6 个组氨酸的核苷酸序列引入到目的蛋白编码的 N 端，6 个组氨酸没有免疫原性，一般不影响蛋白的折叠和干扰重组蛋白的结构和功能，同时,组氨酸靶最大优点是允许重组蛋白固定于金属鏊合表面，利于重组蛋白纯化。BACE 基因定位于 11 号染色体上，其 mRNA 有 7.0、4.4、2.6 kb 三种转录形式，编码 501 个氨基酸。BACE 可以切割 APP 上的 Asp1 或 Glu1(A 上第一位氨基酸)分别释放出其氨基端膜外结构域 sAPP 和 sAPP、APP 的羧基端，即膜
14、结合片段，随后被 分泌酶作用产生全长的 A1 40/42 或氨基端缩短成 A11 40/425。虽然 BACE 的结构已经清楚，但是究竟是何种原因诱导 A 经过 分泌酶途径代谢，目前仍在探讨之中。现今如何防止 A 蛋白, 特别是较疏水的 A42 蛋白片段的形成, 已成为开发药物治疗 AD 的热点。因此，对 BACE 和 AD 之间的关系进行深6入研究，可以进一步对 AD 的发病机制进行探讨，并对开发研制新的预防和治疗AD 的药物提供一定理论基础。近年来国际上许多研究机构致力研究 分泌酶，以便于寻找抑制 A 形成的有效措施6。特别最近出现的 RNA 干扰技术，使靶向 BACE 治疗 AD 越来越
15、受到人们更多的关注和期待。但目前 BACE 抑制剂治疗 AD 主要面临两个问题7，一是 BACE 广泛分布在体内各种细胞，其作用底物不止 APP 一种，完全抑制它可能会带来继发性的毒性，并且 AD 需要长期治疗，这样会加重它的不良反应；二是患者多在出现症状后才确诊，而此时脑内已有大量的 A 沉积，超过了酶抑制剂的治疗范围。但由于 A 在 AD 中的重要作用，只要部分抑制 BACE 就可以使 A 水平下降 3050，即可有明显疗效，而抑制 A 的形成也可以有效地清除已经形成的淀粉样斑块。另外，由于 BACE 的同源蛋白 BACE 2 在抑制剂的选择上与 BACE 非常类似，而 BACE 2 可能
16、在心血管系统中发挥一定的作用，仅部分抑制就可能致病。由此可见，通过识别、分离、纯化分泌酶，选择性抑制 分泌酶的活性，可能减少 A 的产量，从而预防及改善 AD 症状这将是重要的研究方向。【参考文献】1 Selkoe D. The molecular pathology of Alzheimers diseaseJ. Neuron, 1991; 6(4):487 98.2 Vassar R. The beta secretase, BACE:a prime drug target for Alzheimers diseaseJ. J Mol Neurosci, 2001;17(2): 157 70.3 Lee JM, Bo JH, Chung IS,et al.Expression and characterization of recombinant
