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1、华中卅技土学同许医学院嘎士学挂论文肺癌组织中端粒酶的表达及意义华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科研究生李向阳导师白明教授摘要目的：探讨端粒酶活性在肺癌组织及肺良性疾病组织中的表达，并探讨端粒酶与肺癌组织学类型、淋巴结转移及肿瘤临床分期间的相关性。方法：采用T R A P P C R E L I S A 定量法及原位杂交定性方法，检测4 4 例手术切除标本端粒酶活性及h T E R T 的表达，其中包括3 0 例肺癌组织和1 4 例良性病变及正常肺组织。结果：( 1 ) T R A P _ P C R E U s A 检测端粒酶活性肺癌组织明显高于肺良性病变和正常肺组织( P 0 0 5
2、 ) 。( 5 ) 端粒酶活性，h T E R T阳性率在不同时期肺鳞癌中表达差异无显著性( P o0 5 ) 。( 6 ) 3 0 例肺癌组织中2 2 例( 7 33 ) ，同时表达端粒酶和h T E R T ，端粒酶活性与h T E R T 呈正相关( P O 0 5 )( 5 ) T h e r ew e r en os i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c ea m o n gd i f f e r e n tc l i n i c a ls t a g ei nt h el e v e lo f t e t o m e r a s ea n
3、 dt h ee x p r e s s i o no f h T E R T m R N A ( P 00 5 )( 6 ) T e l o m e r a s ea c t i v i t yw a sb e t t e ra s s o c i a t e dw i t hh T E R T m R N Ae x p r e s s i o nw i t hac o m c o r d a n c eo f 7 3 _ 3 fP 5 0 ) 。五、统计学方法：用t 检验、x 2 检验、四格表确切概率法进行统计学处理。统计学显著性意义水平为P O 0 5 ，表2 )莘中崭技袁学霉济矗学簏硅
4、士学攮论文表2 不同病理类型肺癌标本的端粒酶活性水平3 、溃粒酶在蠢无漤銎缝转移熬耱癌中熬溪滢承乎3 0 例肺癌中，2 2 例伴有淋E 曼- 结转移，8 倒不伴有淋巴结转移，有淋融结转移的肺癌的端粒酶活性水平要高于无淋巴结转移者，麓异有统计学意义( P o 0 5 ，表4 )液4 蕊粒酶凌不嚣l 运瘩分麓l 搴瘗中藜表达级阉琵鞍P o 。0 5二、原位杂交法检测h T E R T 在肺癌组织中的表达1 、h T E R T 的定位零研究显示h T E R T 定位在绥腿浆中必稼麓色曼色。( 舔片1 - 5 )2 、h T E R T 在肺癌及肺良性组织中的表达3 0 例肺癌切片中有2 5 例h
5、 T E R T 呈阳性表达，阳性率为8 33 ，而肺良性组织中龊l 弼炎往骰游麓经表达耪，其余骜为麓经，粥淫露为7 1 4 ，与黪瘘经缀9牟辛獬蔽走学焉涛正学院鳗士学位语文相比差异有显著性( P o0 5 ，表6 )表6h T E R T 杰薅鳞癌嚣豫癞中表达熬魄较1 k - - 0 5 3 44 、h T E R T 霞蠢无漤巴结转移虢癌翡表达肖淋巴结转移的肺癌h T E R T 夜达阳性率商于无淋巴结转移者，差异有统计学意义( P 00 5三、肺癌组织中端粒酶活性T R A P - P c R - E L I s A 法和原位杂交h T E R T 检测之间的关系。在3 0 例肺癌组织中
6、有2 2 例T R A P P C R - E L I S A 法和原位杂交h T E R T 法均为阳性，二者一致率为7 33 ，T R A P P C R E L I S A 法和原位杂交h T E R T 法二者问有很好的相关性。( P 0 0 5 )讨论一、酶在肺癌中的表达l 、端粒酶与肺癌的相关性端粒酶与恶性肿瘤之间有较高的相关性。端粒酶的活性几乎在所有人体恶性肿瘤中都检测得到，而正常细胞、组织( 生殖细胞除外) 仅微弱表达1 1 0 1 。有学者在总结了近几年国内外相关材料比较后发现：恶性肿瘤组端粒酶活性阳性率可高达8 4 9 5 ，而良性肿瘤及癌旁组织的阳性率仅为4 左右【1 1
7、 1 。我们的研究结果显示：T R A P P C R E L I S A 法测得肺癌组端粒酶活性明显高于良性肺组织( P o 0 1 ) 。原位杂交法检测h T E R T 显示：肺癌组织阳性率为8 33 ，而良性组织则仅为7 1 4 ，二者差异有显著性( P 0 0 1 ) 。这提示端粒酶的阳性表达与肺癌相关。端粒酶活化参与了肺癌的发生，那么，端粒酶在肺癌组织中强表达可能给病理学鉴别病变的良、恶性提供一个很好的标志物。本实验的结果与许多文献报道一致。C h e l aW 等【”1 分析了6 8 例肺癌及癌组织端粒酶活性和h T E R T ，其阳性率分别为7 9 、9 13 和0 、1 0
8、 2 ( 7 1 6 8 ) ：s h i b u y aK 等I ”1 检测了正常肺组织或肺炎组织、鳞状上皮化生组织、重度不典型增生组织、肺癌组织中h T E R T m R N A 表达水平，其水平是逐渐升高的，表明端粒酶活性增高是旱雩幸 藏点学嗣舜瘟学麓强舌学佳静文肺癌发展早期阶段的特征，到了晚期其端粒酶活性水平更离。l 豢癌魏发生糗澍滏不完全清楚，瞧已疆礁耱瘗夔生成楚多基蠢，多步骤翁互相协同、互相作用的癌变过程 ”1 。目前有很多肿瘤形成学说，包括原瘸基因的激溜和抑癌基因的失活学说l I 。最近提出的端粒酶学说将细胞衰老和肿瘤联系惹皋，壤装是染色蒋夔兹瑾拳镳，它对象惫 誊起保护佟矮，隧
9、壹染戴髂的耪互融合，重组，保证有丝分裂时染色体分离的精确性I 博) 。端粒酶是一种由R N A和蛋白质组成的特殊转录酶，与舆生物细胞线状染色体末端特定的核苷酸序列泰结秘静臻装戆合旗有关 6 1 。端耱酶毵戳臻越瓣5 穗戈零| 耱，爨身兹R N A 缰分为模板，从头合成端粒以修补细胞分裂时染色体的末端的缩短，端粒一端粒酶学说实质上即端豢矗的缺失和端粒酶的激活。爨粒是缀怼袁熊分袋夔生魏镑。蘧羞缝戆豹每一次分袈，壤粒D N A 不錾丢失而缩短，当其缩短到一定的长废，可触发菜种信号，使细胞进入第一致死期M 1 ，从而退出细胞阁期而死亡：如果细胞被病毒转染，或者絮些抑癌基因如P 5 3 、P 1 6 、
10、R b 突交，缡魏可越过M I 麓孬继续分装，薅粒继续练短，当达到一定莛时，细胞进入第二致死期M 2 ，此时染色体可能融现形态异常，大多数细胞由于端粒太短失去对染色体的保护功能而死亡，但极少数细胞程此阶段进一步激活褒粒赫簌蠢遴避死亡，曩毒无葭灞建憝力“ 1 。璇粒酶豹激瀵馒蓑粒长菠褥良稳定，细胞获得无限糟殖能力，成为永生细胞，丽获得永生设是细胞恶变酌关键。近年来还证实1 8 】，人类肿瘤细胞广泛存在端糙酶活化和B c l 2 过度表达，提示臻粒辩涯瞧龟受臻溺亡蓥嚣B e l 2 鹣谖节。黎毅薅豹活 雯彀影噙瑟癌缨鼹凌亡，W a n gJ 等也发现肺癌组织中h T E R T 与B c I 一2
11、 的正相关，与肿瘤细胞的凋亡负相关，W a n g ，X 等用h T E R T 的反义核替酸抑制A 5 4 9 细胞株端粒酶活性，弱辩巍改交了绥熬懿凋亡。猩本实验中，部分肺癌组织端粒酶活性及h T E R T 无表这。H i y a m aK f 2 1 1 认为N S L C C 肿瘤细胞中包含有濒死的M 2 期前细胞，其内端粒辩未极端缩短，端粒酶瀣寒重蔌表达，德试为臻粒酶激活瘩孚缀豫是各耱瘩孛濒瑟缨爨与永惫鳃蕤的比率的反映，A l b a n e l lJ | 2 2 1 等则认为对端粒酶阴性肿瘤的解释有以下几个方面：( 1 ) 端粒酶的激活在端粒延长后受到抑制；( 2 ) 端粒酶低调与
12、细胞静息状态有关；( 3 ) 滚粒酶激溪与瑟矮捡溅方法专关；( 4 ) 可鼹逶遥改交撬截霞嫠寒蠛复芊中耕技土学同许医学院糠士学披论文制I 司题。2 、端粒酶活性与肺癌临床病理圊索间的关系事实验遴过溺定l 奉瘸组织蘧鞋懿溪往及h T E R T 表达。凑提均嚣示：臻粒黪活性与肺癌的淋巴结转移相关，有淋巴结转移者肺癌组织端粒酶活性、h T E R Tm R N A 阳性率均高于无淋巴结转移糟；端粒酶活性、h T E R T m R N A 阳性率与肺瘗经织鳞痰、藤痉瘘理貘垄无关，与赫痉T N I v l 分麓无关。键辙 2 3 氇援道，壤粒酶的活性与肺癌的肿瘤大小、病理类型、临床分期不相关。H a
13、 v eH 等f 2 4 l 手鼹道端粒酶的活性、h T E R T 与肺癌者淋巴结转移相关。H T E R T 阳性肺癌患者术崩生存袭短。G o n a l e r 固u e v e d o R 等牡5 I 甾认为薅粒酶辍缝躲藏痰惑蠹拳嚣瓣瘙容器复发，感判断肺癌患者预后的指标。二、端粒酶活性、h T E R T 检测的临床意义。逶蓬瓣努众多赘实猃终果看，漩粒夔活缝，h T E R T 检溺可馘刿瑟l 毒翳瘸熬良恶性，预见肿瘤增礅潜能、侵袭性，对胂瘤的转移和复发掇供早期的参鸯，判断肿瘤患者的预后，为临床上治疗方式的选择提供帮助。M a r c h e t t iA 等通逑分援T N Ml 麓懿
14、黪癞爨考治疗方式及蠛粒酶溪J 羧，建议鼹予潢粒酶活缝竣逡的肺癌患者术后应给予辅助治疗。G a u t h i e rL R 等【2 7 慵H e r E P 4 包被的免疫磁珠分离血液中的上皮细胞，然后检测端粒酶活性，1 5 例I I I B 或I V 期肺癌患者1 1镶蘧粒戆麓淫，两3 0 铡毽瘫对照蠹无一铡嚣缝。S e nS 2 8 等分爨支气管缓撵l 敬的痰液，支气管冲洗液，支气管镜活性标本端粒酶活性与肺癌诊断的关系。在4 2 例怀疑为肺癌及l O 例虽有临床不适，但不能证明肺癌患者中，端粒酶阳性率：痰滚标本为8 1 ，6 0 1 5 2 ) ，诤洗滚繇本舞6 8 4 ( 2 6 5 2
15、 ) ，溪梭标本为8 6 。8 ( 3 3 5 2 ) ；细胞学或病理学证实是肺瘸，端粒酶阳性检出率：痰液标本为3 9 s ( 1 5 5 2 ) ，冲洗液标本为6 3 、9 ( 2 4 5 2 ) ，活检标本为8 4 ，2 ( 3 2 5 2 ) 。在最初细照学或缀织学诊瑟不怒耱瘗懿恚誊，粼其溃蕴酶獭洼翥：痰波器本t 6 ( 4 2 ) 、冲洗液标本2 0 ( 5 26 ) 、活性标本2 0 ( 5 2 6 ) ，最后经过病理学复查确诊为肺癌。由此可见，对于痰液、支气管冲洗液及支气镑镜检标本端粒酶的检测可咀 乍为细纛学及病理学熬辏韵渗叛。T P A P 方法是端粒酶活性测定的经典方法，藏基本
16、原理是：端粒酶能在特殊的引物束端合成端粒D N A 重复序列，再以P C R 方法扩增合成产物，最后通过华_ P 科杖大学闾许医学院硬士学位论文检测端粒D N A 重复序列的存在来判断端粒酶活性的存在。其中具有灵敏度高、特异性强的特点。近年来在定量和简便方面得到了改良【2 9 1 ，但不直观，操作复杂，需要新鲜组织和同位素标记，不能用作病理学的回顾性研究和检测。原位杂交法是将切片中待测的h T E R T - m R N A 与一条已知的特异性标记的单链核苷酸探针杂交，然后用免疫细胞化学方法在原位进行显色，具有直观实用的特点。它不仅具有分子杂交技术的特异性、灵敏度高的优点，还兼备组织化学中染色的可见性和定位性。本研究表明用原位杂交技术检测h T E R T 在肺癌中表达与用T R A P 测定端粒酶活性一致。这与M a r c h e t t iA 等f 3 0 1 的结论相一致。用原位杂交法测定端粒酶
