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1、1胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞增殖和 ERK 表达的影响作者：姜志茹，龚均，张珍妮，曾文斌【关键词】 胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节 MAP 激酶类Influence of bile acid on proliferation and ERK expression in human normal esophageal epithelial cells【Abstract】 AIM: To observe the influence of bile acid on cell proliferation and the expression of extracellular signa
2、lregulated protein kinase (ERK) in human normal esophageal epithelial cells in vitro. METHODS: Human normal esophageal epithelial cells cultured in vitro were exposed to media containing 6 different kinds of bile acids (250 mol/L) respectively for 360 min, in comparison with the control group (in no
3、rmal media without bile acid). Cell proliferation was assessed using MTT and flow cytometry. The expression of phosphorylated ERK1/2 protein was determined by the immunoblotting technique. RESULTS: Bile acidexposed (312 min) esophageal epithelial cells exhibited a significant increase in proliferati
4、on, especially in S phase of the cell cycle, and the level of phosphorylated ERK1/2 protein. While the bile acidexposed period exceeded 20 min, esophageal epithelial cells exhibited a degression in proliferation and proportion on S phase of the cell cycle. CONCLUSION: The brief exposure in bile acid
5、 increases the proliferation in human normal esophageal epithelial cells by activating the ERK pathway.【Keywords】 cholic acid; esophagus/cytology; cell proliferation; extracellular signalregulated MAP kinases【摘要】目的： 观察胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和 ERK 表达的影响. 方法： 体外培养人正常食管黏膜上皮细胞，分别在含有 6 种不同胆酸（250 mol/L）的培养液中培养
6、360 min，并设对照（培养液不含胆酸）进行比较. 采用MTT 法和流式细胞技术测定细胞增殖状态. 免疫印迹法测定磷酸化 ERK1/2 蛋白表达. 结果： 胆酸的短时间（312 min）作用使细胞增殖比大于 1，S 期细胞比率升2高，磷酸化 ERK1/2 蛋白表达增加. 当作用时间大于 20 min 时，细胞增殖比和 S期细胞比率下降. 结论： 胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖，与ERK 表达上调有关.【关键词】 胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节 MAP 激酶类0 引言近年来随着国内外食管反流性疾病的增加，对十二指肠胃食管反流的研究日渐深入. 反流物中的胆汁主要由胆酸组
7、成，胆酸在反流性食管炎、Barrett 食管以及食管腺癌的发生发展过程中起着重要作用1. 目前胆酸对食管细胞作用的信号传导机制研究尚少. 丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)是细胞内信号转导的重要信号分子，细胞外信号调节蛋白激酶 (extracellular signalregulated protein kinase, ERK)是 MAPK 通路的主要途径之一，与细胞的增殖凋亡有关2. 为了进一步探讨胆汁反流的致病机制，本文首次研究了胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和 ERK 表达的影响.1 材料和方法1.1 材料人角朊细胞培养液
8、 KSFM（keratinocyte serumfree medium）及牛垂体提取物（BPE）,重组表皮生长因子（rEGF）（Gibco 公司）. 甘氨胆酸钠(GC),甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC),牛磺胆酸钠(TC),牛磺鹅脱氧胆酸钠(TCDC),胆酸(CA)及脱氧胆酸(DCA)（Sigma 公司），分别溶于 KSFM 制成 250 mol/L 的胆酸溶液. 抗人细胞角蛋白 14 单克隆抗体（CK14）（上海长岛生物有限公司）. 抗磷酸化 ERK1/2 抗体、抗 ERK1/2 抗体（美国 CST 公司）. RIPA 细胞裂解试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）. BCA 蛋白定量试剂盒、E
9、CL 试剂盒（美国 Pierce 公司）.31.2 方法1.2.1 细胞培养、鉴定和分组取材于食管癌手术切除的正常食管黏膜组织，进行病理检验，仅选取病理诊断正常的标本进行细胞培养. 标本获取经患者同意. 标本采用无菌收集，保存于 4无菌 KSFM，4 h 内进行原代细胞培养，具体操作参照已有的方法3. 获取的食管上皮细胞于 KSFM（无血清培养液，含有 BPE 和rEGF）中，在 37, 50 mL/L CO2 条件下培养. 第 1 次传代培养后进行 CK14 的免疫细胞化学染色鉴定细胞. 实验组细胞于无 BPE 和 rEGF 的 KSFM 中同步化培养 48 h 后，分别在 6 种胆酸溶液中
10、培养 360 min. 以正常培养液中培养的细胞为对照组.1.2.2 细胞增殖分析将细胞接种于 96 孔板，5103 细胞/孔. 胆酸作用结束后以正常培养液继续培养 24 h, MTT 法检测细胞增殖情况. 在每孔培养液中直接加入10 L MTT 溶液 (5 mg/mL)，4 h 后弃去培养液，用 100 L 二甲基亚砜裂解细胞. 于 490 nm 测定吸光值，计算细胞增殖比，增殖比=实验组吸光值/对照组吸光值.1.2.3 细胞周期观察将细胞接种于 6 孔板，5105 细胞/孔. 胆酸作用结束后以正常培养液继续培养 24 h，胰酶消化收集细胞，PBS 洗涤一次. 每个样本约 106个细胞，加入
11、 750 mL/L 冷乙醇固定 4保存. 以 50 g/mL 核糖核酸酶和 50 g/mL 碘化丙啶染色，流式细胞仪（FACSCalibur 型，美国 BD 公司）观察 G1, S 和G2 相的细胞比率，以及细胞凋亡率.1.2.4 磷酸化 ERK1/2 蛋白水平的测定采用 Western 免疫印迹法. 细胞经胆酸作用 3 min 后，依据 RIPA 试剂盒说明书提取细胞内总蛋白，BCA 法检测蛋白浓4度. 以 50 g 蛋白上样进行 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V 恒压电泳约 25 min，待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处换 120 V 恒压电泳约 1 h，使溴酚蓝全部电泳出分离胶
12、底部. 电转法(110 V，3 h)将分离胶上的蛋白转移到 PVDF 膜上，分别与抗磷酸化 ERK1/2 抗体（11000 稀释）、抗 ERK1/2 抗体（11000 稀释）4孵育杂交过夜. ECL 法检测蛋白条带，X 线曝光. 凝胶电泳分析系统定量条带相对灰度，以磷酸化 ERK/总 ERK 比值判断结果.统计学处理： 每组实验独立重复 3 次. 实验结果以 xs 表示. 多组均数比较用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法，P0.05 时有统计学差异.2 结果2.1 人正常食管黏膜上皮细胞的生长特性细胞单层贴壁生长，卵圆形. CK14 是食管上皮细胞的骨架蛋白，免疫细胞化学染色显示第 2
13、代细胞均表达 CK14.2.2 人正常食管黏膜上皮细胞在胆酸作用下的形态学变化相差显微镜下（250）观察发现，对于 GC, GCDC, TC, TCDC, CA 五个实验组，细胞在胆酸作用（360 min）前后无明显形态学变化. DCA 组当作用时间为 320 min 时，细胞在DCA 作用前后无明显形态学变化；当作用时间超过 40 min 时，部分细胞出现折光性减低、细胞皱缩. 2.3 细胞增殖测定测定结果如图 1, GC, GCDC, TC, TCDC, CA 五个实验组的增殖比为 0.9520.1541.3440.139，增殖比大于 1 或略小于 1，呈增殖趋势. DCA组当作用时间为
14、312 min 时，增殖比为 1.1140.1631.3460.170，大于 1 呈增殖趋势；当作用时间大于 20 min 时，增殖比为 0.7910.1080.4310.109，小于 1 呈5凋亡趋势.2.4 细胞周期测定检测结果如表 1，当胆酸作用时间为 3, 12 min 时，GC, TC, CA, DCA 四个实验组的 S 期细胞比率高于对照组(P0.05)，各组间的凋亡率无明显差异. 当胆酸作用时间为 40 min 时，GC, TC, CA 组的 S 期细胞比率、凋亡率与对照组相比均无明显差异；但 DCA 组的 S 期细胞比率降低，凋亡率明显增加(P0.05).2.5 磷酸化 ERK
15、1/2 的表达如图 2 所示，当胆酸作用时间为 3 min 时，与对照组相比，各实验组的磷酸化 ERK1/2 表达增加(P0.05). GC 作用 3 min 后 0, 5, 15, 30 min 时分别测定磷酸化 ERK1/2 表达(图 3)，GC 作用刚刚结束时磷酸化ERK1/2 表达最高水平，随时间延长表达水平逐渐下降，15 min 以后接近对照组水平.图 16 种胆酸作用 360 min 对细胞增殖比的影响（略）表 1 胆酸作用 3, 12, 40 min 对 S 期细胞比率、凋亡率的影响（略）aP0.05 vs 对照.图 2 胆酸作用 3 min 对各组 ERK 表达的影响（略）图
16、3GC 作用后 30 min 内的 ERK 表达（略）3 讨论近年来的研究发现反流性食管炎、Barrett 食管均存在细胞增殖提高4，就此有学者研究了酸对细胞增殖的影响，发现酸可使体外培养的 BE 组织5和 Barrett6相关腺癌细胞系(SEG1)的细胞增殖率升高6. 随后有研究表明，GCDC 的短时间作用（20 min）也对 SEG1 细胞具有促增殖效应7. 这提示反流物可能是通过引起增殖异常导致了食管炎症、肠化、癌变一系列病变的发生. 由于人正常食管上皮细胞的原代培养在很长一段时间内存在问题，既往的报道均局限于病理状态下食管细胞的研究. 我们通过新近建立起来的人正常食管上皮细胞的原代培养技术3，第一次报道了胆酸对人正常食管上皮细胞增殖的影响，以进一步探讨反流性疾病的发病机制.我们将正常食管上皮细胞分别于 4 种结合胆酸和 2 种非结合胆酸中培养 360 min，基于 Barrett 食管患者的食管抽吸物中的平均胆酸浓度8我们选取了 25
