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1、1细胞外基质与多囊肾病发生发展之间的 关系【关键词】 多囊肾病(PKD);多囊蛋白(PC);细胞外基质重构多囊肾病(polycystic kidney disease，PKD)是一种与肾小管上皮细胞异常增殖，内含液体的囊泡形成与增大以及细胞外基质异常有关的疾病1。常染色体显性遗传 PKD(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)的发病率介于1/10001/400，是最常见的一种 PKD2，占我国终末期肾衰竭病因的第 4 位。至少有 3 种基因 Pkd1、Pkd2、Pkd3 突变可以引起 ADPKD，其中 85%是由 Pkd1 突变引
2、起的。Pkd1 基因表达产物为多囊蛋白-1(PC1)，目前认为 PC1 结构功能缺陷是肾囊泡发生和发展的主要原因。斑马鱼实验模型研究提示，与人类 PKD 基因高度同源的 pkd1a/b 和 pkd2 与调节细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的分泌和装配有关，从而改变基质完整性，这可能是 ADPKD 病变中的病理学基础之一3。以人类 ADPKD 肾为材料，采用标准 EnVision 免疫组织化学方法(又称 ELPS 法)的研究表明，PC1 的异常表达可以引起多种细胞外基质的异常4。PC1 具有特殊的胞外功能域，这些功能域被证明与多种细胞外基质组分有联系。近期研究者们综
3、合应用多种方法研究细胞外基质与多囊肾病发展的关系，并试图通过调控细胞外基质的重构，抑制多囊肾病的病程发展，许多抑制细胞外基质重构的药物也应用于动物 ADPKD 模型中。 本文将从 PC1 结构和功能，PC1 与细胞外基质的联系，细胞外基质与 ADPKD 发展的相互影响和通过影响 ECM 重构而在 ADPKD 病程发展中起抑制作用的药物几方面介绍细胞外基质与多囊肾病的发生发展之间的关系。21 多囊蛋白 1(PC1)1.1 PKD 基因将斑马鱼的 PKD1 同源基因 pkd1ab 敲除引起背轴弯曲、脑积水、软骨和颅侧缺陷，前肾低频率(10%15%)的囊泡形成。在敲除 PKD2 基因的个体中则重点表
4、现为背轴异常弯曲。研究提示 ipkd1a/b 和 pkd2 与调节 ECM 分泌和装配有关，从而改变基质完整性，这可能是 ADPKD 病变中的基础缺陷之一3。1.2 PC1 的结构与功能PC1 功能域中包括位于 N 端附近的两个富含亮氨酸的重复序列(LRR)，其两端分别为富含半胱氨酸和羧基区域，合称 flank-LRR-flank。flank-LRR-flank 排列与蛋白质-蛋白质间联系密切相关5。还包括一个糖基化的 C 型凝集素功能域。15个 Ig 样重复序列连续排列于 C 型凝集素功能域 C 端，另外一个 Ig 样重复序列则位于 C 型凝集素功能域 N 端一侧。紧接着 15 个 Ig 样
5、片段 C 端处的是 4 个纤连蛋白 3 型相关序列。此外，发现在凝集素和 Ig 样重复之间存在一个富含半胱氨酸的，低密度的脂蛋白 A 功能域6。在正常情况下，这些功能域排列于细胞外并且参与细胞-细胞或细胞-基质间联系。2 PC1 与 ECM 的联系2.1 PC1 与信号转导近期研究显示 ADPKD 肾中的失去极性的上皮细胞可以异常表达上皮生长因子受体和具有 Na+-K+-ATP 酶活性的膜蛋白7。这种异常表达是由于胚胎基因ErbB2 和 Na+-K+-ATP 酶 -2 亚基基因没有正常关闭所致。有学者提出一种可能3的模型，认为 PC1 参与了上述基因的表达调控8。根据这个模型，正常情况下，PC
6、1 通过与细胞外成分结合而获取信息，并通过其 C 端磷酸化信号传导调控基因转录。在 ADPKD 细胞中缺乏这种信号级联反应，引起基因转录异常导致肾的异常发育。在 PC1 与基质配体，比如整合素簇和粘着斑复合体结合后，这些配体被酪氨酸蛋白激酶如粘着斑激酶和 Src 磷酸化而产生活性，进一步引起下游的级联反应影响活性基因调控蛋白(active gene regulatory protein,AP-1)依赖型基因的转录9。除了通过调控 AP-1 依赖型基因的转录，PC1 还被发现能通过 wnt 通路调节TCF 依赖型基因的转录。PC1 抑制中间转导物糖原合酶激酶-3(glycogen synthas
7、e kinase-3，GSK-3)的磷酸化，从而导致 -连环蛋白的稳定性增加而积聚，-连环蛋白又可以与转录因子 TCF 结合成为复合体，从而激活 TCF 反应性基因的转录10(见图 1)。图 1 PC1 通过 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)途径调节 AP-1 类基因的表达以及通过 Wnt 途径调节 TCF 反应性基因的表达哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白简称 mTOR，此通路在正常情况下被抑制，在 ADPKD 中则被激活，mTOR 影响胶原蛋白的合成与稳定,并与 TGF- 和 v3 整合素信号通路相互作用,影响细胞外基质的产生。PC1 可以调节 mT
8、OR 和转录因子 STAT6 通路。薯球蛋白是结节性硬化基因-2(tuberous sclerosis2,TSC2)的编码产物，是mTOR 途径中的重要调节因子。mTOR 活性依赖于小片段 G 蛋白的 GTP 结合状态，薯球蛋白通过其 GAP 功能域调节这些小片段的 GTP/GAP 状态发挥功能。GAP 有活性的前提是与错构素(一种 PKD1 编码产物)结合形成复合物，这种薯球蛋白-错构素复合物在正常情况下抑制 mTOR11，12。ADPKD 中 PKD1 的突变或缺失导致薯球蛋白呈游离状态，并可以作为 Akt 和 RSK1 等激酶的底物而激活mTOR。这又会引起上皮细胞对生长因子的敏感度上升
9、而激活 PI3K 或 Erk 通路。4EGF 受体信号导致的 Erk 激活已经在多种人类和动物的囊化性疾病中有所记录13。2.2 PC1 与细胞外基质组分的关系有学者提出 PC1 作为细胞外基质受体通过粘着斑蛋白联系 ECM 与肌动蛋白细胞骨架。免疫共定位和免疫共沉淀结果表明在正常胚胎肾和亚融合上皮细胞培养中，PC1 与 21 整合素、踝蛋白(talin)、纽带蛋白(vinculin)、桩蛋白(paxillin)、P130cas、粘着斑激酶和 c-src 形成多蛋白复合物。在正常成人肾和融合上皮培养中，PC1 表达下调并与 E-钙粘素和 、-连环蛋白形成细胞之间连接。抑制酪氨酸磷酸化和细胞内钙
10、离子浓度上升引起 PC1-黏着斑蛋白复合物相对于细胞间连接复合物增多10。用酪氨酸磷酸化抑制剂处理细胞后，PC1 与 FAK 的联系被切断，同时 PC1 与 -连环蛋白连接，提示 PC1 通过酪氨酸磷酸化而调节细胞分化14。在发育和突变的过程中，PC1 的分布由细胞-基质粘合转向细胞间连接。提示 PC1 可能以此方式调控细胞分化。从结构上讲，除了 PC1 N 端富含半胱氨酸的区段被发现与多种粘着斑蛋白有关联。对 PC1Ig 样功能域序列 10 的核磁共振结构分析表明，从人类到河豚中均有一个 Ig 样 折叠也可以与细胞外基质结合15。此外，PC1 最末端的 1000AA 序列与海胆卵胶受体有高度
11、同源性，其功能不清。近期，海胆卵胶受体(REJ)家族的其他成员在人类睾丸中被发现16。尽管 PC1 中此功能域的作用尚不清楚，但在海胆中它与精卵接触后，钙离子流入从而改变精子膜结构以受精中起到作用。可能在 PC1 中此结构也有类似的介导钙离子流入的功能。钙离子浓度的变化又可以调节多种下游级联反应的发生与程度，从而调节细胞的增殖和分化。ADPKD 细胞中，细胞内钙离子浓度降低也是其过度增殖和低分化产生的原因之一。53 多囊蛋白-2(PC2)与细胞外基质多囊蛋白-2(PC2)是定位于 4q1222 的另一种多囊肾基因 PKD2 的编码产物。尽管 PC2 结构中有多个功能域与 PC1 同源，但与 P
12、C1 不同的是，PC2 的 N 端和C 端都位于细胞内。尽管人们对 PC2 的结构还不是很清楚，但人们假定 PC2 的 C端存在一个特殊的盘绕的功能域，PC2 通过此功能域与 PC1 相连17。在 PC2 的C 端发现了一个 EF 手样的基序。EF 手样基序包含多个钙离子结合位点并，并可能以单体或多体形式存在并根据其结构不同，发挥催化酶促反应或调解细胞内钙离子水平的作用。另外，Tsiokas L 等在 1999 年发现 PC2 和与果蝇基因 TRPC 同源基因编码的钙离子流入通道相连18，这种表达产物在哺乳动物表现为一种非选择性的，钙离子可渗透的阳离子通道，允许钙离子流入细胞。对 PC2 功能
13、的理解不像 PC1 那么深入。除了与 PC1 共同形成复合体调节细胞内钙离子水平以外，近期的多项研究表明，除了与 PC1 相关的功能，PC2 本身也有许多作用。比如关于信号转导的研究发现，PC2 可以像 PC1 一样，激活 AP-1 依赖型基因的转录。与 PC1 不同的是，它不仅可以通过 c-Jun 终端激酶途径达到此功能，也可以通过丝裂原激活的蛋白激酶途径。后一种途径可以被钙离子非依赖性的 PKC 调控19。另外，PC2 被发现与 Hax2,一种与肌动蛋白细胞骨架相连的蛋白质有联系20。这些都提示 PC2 可能通过调控蛋白质合成等方式与 ECM 联系，但对 PC2 的结构功能还需要更多的研究
14、。4 细胞外基质和 ADPKD 发展的相互影响4.1 细胞外基质重构6ECM 发生重构是 ADPKD 发展的标志性改变之一。ECM 调节细胞的增殖与分化可能是通过直接作用和间接作用。多数构成 ECM 成分的分子结构中均有促进细胞分裂的 EGF 样功能区。在正常情况下，ECM 的 EGF 功能区遮蔽，在创伤后被暴露，刺激细胞分裂。体外实验证明：层连蛋白 LN 的 EGF 样结构能促进成纤维细胞和表皮细胞的增殖。一些 ECM 分子如珍珠素和修饰素能与细胞因子结合，不仅具有贮存细胞因子的作用，而且有调节这些细胞因子活性的作用，从而间接调节细胞的增殖和分化。Candiano 等发现在富含一型胶原的培养
15、基中培养的MDCK 细胞形成囊泡，提示细胞外基质中的某些胶原成分可能与囊泡形成发展有密切联系21。另一方面，随着 ADPKD 的发展，囊泡中液体不断渗出，体积增大。随着囊泡生长和液体堆积，相连的细胞外基质开始进行重构。在单层培养的MDCK 细胞中，牵拉细胞膜下的支持物可以引起细胞增殖。此外，上皮细胞表面的初级纤毛也通过调节某些基质蛋白的表达而参与此过程。肾的纤毛是由微管构成的，黏着于小管和集合管膜表面的突出物。它被报道可以对细胞内上升的钙离子流入感应并反应22。许多研究表明 PC1 和 PC2 位于初级纤毛，并可以作为短暂的有通道潜力的受体，感受并调节细胞内钙离子浓度。纤毛弯曲引起钙离子通过
16、PC2 的通道流入细胞内23。这种感知能力在 PC1 突变的细胞中消失了。许多PKD 有关的细胞功能，比如包括基质蛋白基因在内的基因表达，细胞周期，分化与凋亡，都被细胞内钙离子浓度所调节。纤毛的功能异常与细胞周期的持续进行有很大关系。PC1 通过上调 p21 激活 JAK-STAT 途径，导致细胞周期停滞于G0/G124。纤毛上的 IFT88/POLARIS 蛋白被证明与细胞周期过渡中中心体密切相关。它的过度表达可以阻止 G1/S 过渡并诱导细胞凋亡。相反，其表达缺失则引起细胞周期持续进行25。PC2 同样可以通过与 Id2，一种螺旋-环-螺旋家族蛋白7(可调控细胞增殖分化)的连接而调节细胞周期。在 PC 结构被描述之前，人们就假定细胞基底膜连接的改变可能是 PKD 的主要病变。现在有充分的证据证明在多数 ADPKD 中，基本的缺陷在于细胞-细胞/基质连接蛋白。小管上皮细胞和 ECM具有相反的序列以相互连接。ECM 与细胞之间的联系被破坏可以
