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1、1组织工程学骨再造在颌骨缺损修复中的 研究进展骨组织的缺损可由多种原因引起，包括肿瘤、炎症、外伤等原因，其中以肿瘤性的骨缺损最为常见，肿瘤性骨缺损修复是今后肿瘤外科修复重建的一个方向1。口腔恶性肿瘤手术往往导致下颌骨或上颌骨的缺损，常用的修复方法有自体骨、异体骨及人工材料等，但目前的这些修复方法难以满足临床的需要。近来，随着组织工程学这门新兴科学技术的兴起，能够利用这项技术达到骨再造而满足临床需要。本文就口腔癌与下颌骨缺损的关系、组织工程学再造骨的重要内容及其修复下颌骨缺损的进展作一综述。1 口腔肿瘤术后下颌骨缺损及其并发症1.1 口腔肿瘤术后下颌骨缺损口腔颌面部具有一个丰富的淋巴系统，口腔癌
2、一般都有下颌骨骨膜的侵犯。Sudhir 对 22 例口腔癌是否侵犯下颌骨进行研究，分别用 X 线、CT 检查，发现有21 例均有下颌骨的侵犯，并且与术后组织学相对照，其阳性率是一致的2。Tsuchimochi 等用 99mTcMDP 骨扫描显示肿瘤引起了下颌骨松质骨的侵犯3。因此从肿瘤外科原则出发，必须作下颌骨切除，势必会引起下颌骨的缺损。1.2 下颌骨缺损的并发症下颌骨缺损不仅仅影响面部美容，更重要的是可以引起如言语、吞咽、呼吸等功能的障碍。McConnel 等对下颌骨切除后的病人进行口咽吞咽效率(OPSE)的检测，发现平均的 OPSE 值明显低于正常值，30 个病例中有 8 例不能进食，其
3、余只能进点流质4。Haribhakti 也证实了下颌骨缺损可引起呼吸困难、睡眠质量差、下齿2槽神经损伤的各种并发症，使患者的生活质量大大降低5。2 组织工程学骨再造的主要研究进展组织工程学(tissue engineering)是生物医学工程中的一个新的分支，是应用生命科学工程学的原理与技术，设计、构造、改良、培育和保养活组织，以修复或重建组织器官的结构，维持或改善组织器官功能的一门新兴的边缘学科。其基本方法是将体外扩增的正常组织细胞，吸附到一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上，然后植入机体缺损部位，细胞在生物材料逐渐降解吸收过程中形成新的组织，达到修复缺损，重建功能的目的。Vacan
4、ti6等运用组织工程技术在裸鼠身上再生软骨，国外已有较多的关于软骨组织的组织工程7；国内曹谊林教授首次采用组织工程技术在裸鼠体内再生了带血管的骨组织，并用于修复骨缺损，为骨组织缺损的修复提供了一条新的思路和途径。骨组织的再生要求有三个基本的生物学因素参与，即细胞、生长和分化因子、细胞外基质材料，这也是当今组织工程研究中的三大课题。源细胞经过培养可以分化成成骨细胞；生长分化诱导因子可以促进成骨细胞的分化增殖，保持成骨细胞不衰老；生物可降解材料可作为细胞支架，支持细胞的附着、迁移和分化8。2.1 种子细胞(成骨细胞)2.1.1 来源的选择理想的骨组织工程学种子细胞应具备下列特点：(1)取材容易，对
5、机体损伤小；(2)在体外培养中易定向分化为成骨细胞和具有较强的传代繁殖力；(3)植入机体后能适应受区的环境并保持成骨活性，有以下四种来源9。32.1.1.1 胚胎骨：目前较多使用的是胚胎或新生动物骨或人胚胎骨。由骨分离出的细胞主要含有4 种成分：骨内膜细胞、骨外膜细胞、骨细胞、未分化的间充质细胞。在体外培养中表现为两种形态：可贴壁的成纤维细胞样细胞和不贴壁的圆球型细胞。利用骨作为来源获得的细胞在体外较易定向分化为成骨细胞，且具有生长迅速，传代繁殖快的优点。但此法会对患者造成手术损伤且供源有限。2.1.1.2 骨外膜：骨外膜分为内外两层。其中内层含有较多的骨原细胞和成骨细胞。已有较多的研究证实1
6、0来源于骨膜的细胞具有很强的传代繁殖和定向分化成骨细胞的能力，植入机体后能适应受区的环境，保持成骨活性，并最终通过软骨成骨而修复骨缺损，是目前广泛应用的成骨细胞来源。2.1.1.3 骨髓：骨髓分造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质，骨髓基质细胞称作成纤维细胞集落形成单位，它具有多向分化潜能。骨髓具有取材方便、对供体损伤小、有流动性和可经皮注射等优点，具有广阔的发展前景。2.1.1.4 骨外组织：骨外组织如表皮细胞、成纤维细胞，这些起源于胚胎时期间充质的骨外部位的骨祖细胞称作诱导性祖细胞(IOPC)。此法取材容易，对人体的创伤较小，体外培养传代繁殖力较强，提供了一条新的成骨细胞来源。2.1.
7、2 成骨细胞与生物降解聚合物的体外培养Attawia11等将成骨细胞种植在聚羟乙酸支架上，并在含 10%胎牛血清的培养4液中培养。710 天后，成骨细胞粘附到聚合物支架上，并发生增殖，培养液中有钙化骨形成。Cooper12也进行了类似的研究，将成骨细胞分别种植到PMA、CPH、PMA/CPH 共聚物上，2 周的体外培养期间，成骨细胞发生了粘附、增殖，表达了较高的碱性磷酸酶活性，并有胶原合成。这些研究说明：种植到支架上的成骨细胞在合适的营养环境中，能与聚合物很好地结合，并保持其增殖和成骨功能。2.1.3 成骨细胞形成骨组织的最佳细胞浓度种子细胞的选择是组织工程修复缺损的关键步骤。适当的种子细胞浓
8、度既可以直接修复缺损，又可以通过分泌细胞生长因子，促进间充质未分化细胞向种子细胞转化，加速愈合13。浓度过低，基质和细胞因子分泌不足，将限制细胞的生长。浓度过高，细胞之间将过早发生接触抑制，在取材上也有困难。夏万尧、曹谊林等的实验选择浓度从 10106/ml70106/ml 的细胞进行研究，并作 HE、Safranin 染色观察，结果确定接种细胞浓度为 50106/ml 时形成的软骨组织最佳4。至于骨组织形成的最佳细胞浓度尚有待进一步研究和探索。2.1.4 成骨细胞与环境的关系2.1.4.1 成骨细胞与细胞基质(ECM)的关系：成骨细胞的 ECM 包括无机和有机两部分，无机盐以羟基磷在石形式存
9、在，主要作用为增强骨组织的力学强度；有机成分以型胶原为主，还包括骨钙素，骨桥蛋白，骨连接蛋白，纤维连接蛋白，层粘连蛋白等无定形基质。目前认为有机成分在成骨细胞增殖、分化过程中发挥重要作用。Nolan15等证实成骨细胞在脱钙骨基质上有很强的粘附和增殖能力。其中型胶原可刺激多潜能间充质细胞向成骨细胞方向转化，并促进成骨细胞表达碱性磷酸酶。52.1.4.2 成骨细胞与物理力的关系：把细胞基质结合物放入铸模里，使它们承受减切力、张力和其他一些在生长过程中受到的已知力，这也是设计和组织工程所需要的。施加物理力是形成和推动基因活动的重要因素，研究证实机械应力可促进成骨细胞表达 1 Intergrin,从而
10、增加成骨量16。2.1.4.3 成骨细胞与血管内皮细胞的关系：在骨的改建过程中，成骨和血管化是密切相关的。血管内皮细胞可合成和分泌一系列可溶性的调节介质，包括生长因子和细胞因子，这些因子具有控制成骨细胞增殖、分化等作用；另一方面，Wang17等证实成骨细胞能分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)、FGF 等促血管形成因子，作用于内皮细胞，促进血管形成。2.2 生物可降解材料生物可降解材料又称为细胞外支架材料，理想的材料应具备下列条件：(1)良好的生物相容性；(2)良好的生物降解性，材料可最终被受植床组织完全替代；(3)易加工成型，并具一定的强度，抑制后能保持原状；(4)材料表面易于细胞粘附且不影
11、响其增殖分化。组织工程中应用的材料有天然材料和人工合成的高分子聚合物材料。天然材料如胶原、脱矿骨等；目前最受人青睐的材料是一些合成的生物降解聚合物如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和 PLA/PGA 共聚物。PLA 和 PGA 具有良好的生物相容性和生物降解性，其代谢产物可通过代谢途径或经肾脏排出体外。学者们对这类材料研究取得了较大的进展，如 Whang 等18采用层压技术将聚合物制成三维立体多孔结构，其孔隙率达 90%，孔的平均大小在 1632 microm，组织形态学观察其成骨量要明显高于对照组，这样的微孔结构给种植细胞提供了较大的粘附面6并有利于粘附的细胞与周围环境交换营养、气体和废
12、物排泄。最近有学者用脱乙酰的甲壳质(chitosan)和磷酸三钙(TCP)复合的海绵球作为成骨细胞培养的基质，发现该材料促进了成骨细胞的增殖和分化，有较高的碱性磷酸酶的表达及矿物化；光镜和电镜显示成骨细胞很好地附着在海绵球表面，并在 14天时看到骨样物质的沉积19。 2.3 生长调节因子生长调节因子主要是生长因子和细胞因子。在组织工程中，某些种子细胞在体外传代培养后，经过一段时间后，细胞极易衰老，而生长因子能调节骨种子细胞的增殖和分化。对成骨细胞起着重要调节作用的生长因子有转化生长因子(TGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，骨形态发生蛋白(BMP)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，血小板衍
13、生生长因子(PDGF)等。成骨细胞本身可合成分泌 TGF，细胞膜上有 TGF 的特异性受体，TGF作用于体外培养的成骨细胞，抑制其 DNA 的合成和 AKP 活性，促进胶原蛋白和非胶原蛋白的合成20。bFGF 起着形态发生因子和促有丝分裂作用，刺激骨细胞的 DNA 合成，减弱 OC、AKP 的 mRNA 表达。PDGF 可促进成骨细胞增殖，但对胶原合成无影响。BMP 可诱导血管周围间充质细胞不可逆地向成骨细胞系方向转化，提高成骨细胞的 AKP 活性。IGF 在骨组织中含量较高，约(1 mg/kg)，可刺激成骨细胞增殖，促进胶原蛋白的合成。Strayhorn21等采用鼠成骨前细胞株 MC3T3E
14、1 和 Northern 杂交分析法研究了各类生长因子对成骨细胞增殖及相关基因的表达，显示单用 PDGF 抑制 IGF 7mRNA 的表达，阻断了骨钙素基因的表达，而单用 IGF 及 BMP 增加相关基因的表达。研究同时发现 PDGF/IGF 合用明显增强增殖分化相关基因的 mRNA 表达，促进了骨的形成。由此可见，生长因子之间的协同或拮抗作用还是很明显的，单一生长因子的作用或其浓度和剂量的改变是否会影响成骨细胞的增殖分化尚待进一步研究。2.4 临床前试验研究临床前试验也即动物实验，其目的在于了解成骨细胞在体内的生长代谢、成骨情况以及生物材料的特性。2.4.1 成骨细胞生物降解材料复合物移植于
15、皮下的成骨作用Levy22等在体外培养研究的基础上，将成骨细胞PGA 复合体移植到裸鼠背部皮下观察其成骨情况。植入后 6 周观察有软骨形成，在侵入的血管周围有新生的骨组织；20 周时，可见大块骨组织形成。由此可见，成骨细胞生物材料植入体内后先形成软骨，然后经历血管侵入和形态发生而形成骨组织。2.4.2 成骨细胞生物降解材料复合物移植修复缺损Lewandrowski23等用种植有成骨细胞聚合物修复骨缺损，以单纯聚合物植入作对照，发现实验组在术后 1 周即出现编织骨组织形成，至第 4 周时，新生骨组织渐趋成熟，至第 8 周时，缺损完全为骨组织充填，生物材料已完全降解吸收，未见免疫细胞浸润，Safr
16、ainin 0 染色阳性。用带血管蒂的骨修复骨质缺损有很多优点，但这种移植材料取材极有限，能否利用组织工程技术来制造这种带蒂的骨修复材料又是当今的一大热点。已有学者24从胎牛肱骨骨膜分离的成骨细胞种植到聚合物支架上，体外培养 2 周后，将8成骨细胞聚合物复合体移植到无胸腺大鼠的右股血管周围，术后 9 周形成了新生的骨组织，最终形成了带血管蒂的小梁骨。3 组织工程学在颌骨缺损修复中的应用下颌骨缺损的修复(尤其是肿瘤性的)一直是口腔颌面外科的难题，研究合适的骨缺损修复材料显得尤为必要。Henning25等在制作小猪下颌骨缺损模型的基础上，把聚乳酸和成骨细胞的复合物植入缺损区，再加上 bFGF，采用三维模式观察骨组织的生长情况。结果发现新生骨组织均可在此支架上附着，并提出了较适宜的 bFGF 浓度为 8 g/ml。组织工程骨再造在颌骨缺损修复的临床前试验有待进一步研究。4 组织工程骨再造的应用前景和存在问题以细胞和生物降解聚
