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1、1肝细胞肝癌中 C2 基因表达与 HBxAg 的关 系作者:张庆 刘杰 李青 李勤 王新 乔泰东 樊代明 【关键词】 肝肿瘤 关键词: 肝肿瘤;肝炎抗原;C2 基因 摘 要:目的 研究蛋白翻译起始因子 C2 在肝硬化(LC)、原发性肝细胞癌(HCC)中表达的意义,并探讨其与 HBxAg 表达的关系. 方法 用免疫组化方法检测C2,HBxAg 在肝硬化(n=27),HCC(n=60)中蛋白水平的表达.Western blot 法检测C2 蛋白在 HCC 及其癌旁组织中的表达. 结果 在 27 例 LC 中,C2 蛋白阳性率为77.8%(21/27),HBxAg 阳性率为 74.1%(20/27)
2、.60 例 HCC 及 42 例癌旁组织中,C2 蛋白阳性率分别占 27.3%(17/60)和 83.3%(35/42).在 HBxAg 阳性的 49 例HCC 中,10 例 C2 蛋白阳性,阳性率为 20.4%,在 HBx-Ag 阴性 11 例 HCC 中,7例 C2 蛋白阳性,阳性率 63.6%.C2 蛋白在 LC 中的表达明显高于 HCC(P0.01),C2 蛋白在 HCC 癌旁组织中表达明显高于癌组织(P0.01);C2 在 HBxAg 阳性HCC 中表达明显低于 HBxAg 阴性 HCC(P0.05).Western blot 与免疫组化结果一致. 结论 C2 蛋白表达下调及 HBx
3、Ag 对 C2 的抑制作用可能与 HCC 发生发展有关. Keywords:liver neoplasms;hepatitis antigens;C2gene Abstract:AIM To study the expression significance of pro-tein translation initiation factor C2and its correlationship with expression of HBxAg in liver cirrhosis(LC)and hepato-cellular carcinoma tissues(HCC).METHODS ABC
4、im-munohistochemical method was used to detect the expression of C2protein and HBxAg in27samples LC,60samples of HCC and42samples of pericancerous tissue.Western blot method 2was used to detect the expression of C2protein in HCC tissue and pericancerous tissue.RESULTS In27sam-ples of LC,the positive
5、 rate of C2protein was77.8%and the positive rate of HBxAg was74.1%.In60samples of HCC and42samples of pericancerous tissue,the positive rate of C2protein was27.3%and83.3%,respectively.Ten samples and7samples were positive for C2protein in49sam-ples and11samples of HCC in which HBxAg was positive and
6、 negative,respectively.Statistical analysis suggested that the positive rate of C2protein was significantly higher in peri-cancerous tissue and LC than that in HCC(P0.01). The positive rate of C2protein was significantly lower in HBxAg(+)tissue than that in HBxAg(-)tissue(P0.05).Re-sult of Western b
7、lot method was consistent with that of im-munohistochemical method.CONCLUSION Low expression of C2protein and the suppression of C2by HBxAg may play an important role in the development of HCC. 0 引言 肝癌(HCC)是危害人类健康的常见的恶性肿瘤之一.我国是 HCC 高发区,也是 HBV 感染率较高的国家1,2 .HBxAg 因能改变和调节某些转录因子的活性及信号转导途径,在转录调节水平上介导肿瘤形成
8、,是 HBV 感染导致 HCC 的重要因子.多种基因的突变与 HCC 的发生密切相关3-5 ,其机制不明.蛋白翻译起始因子和肿瘤的关系日益受到重视,尤其是真核蛋白翻译起始因子(eukaryotic translation initi-ation factor1,eIF1).C2 是刚刚被克隆的人的 eIF1 全长 cDNA 序列6 ,我们利用最新制备的抗 C2(eIF1)抗体,进行免疫组化及 Western blot 法,检测 C2(eIF1)在肝硬化(LC),HCC 中蛋白水平的表达,并观察 HBV 感染与 C2 表达之间的关系,以探讨 C2 在 HCC 发生中的作用.eIF1 在 LC,H
9、CC 中蛋白水平的表达情况. 1 材料和方法 1.1 材料 病理证实肝细胞肝癌 60 例及肝硬化 27 例,为西京医院和陕西省肿瘤医院 1996/2000 外科手术切除标本.其中 HCC 标本 42 例带有癌旁组织;男 52 例,女 8 例;年龄50 岁 37 例,50 岁 23 例;根据 TNM 分级,级 7 例,级 22 例,级 26 例,级 5 例.选自术前未经放疗、化疗,无坏死的肿瘤组织,经 40g L-1 3甲醛固定,脱水,常规石蜡包埋,制备 5m 厚连续切片.免抗 C2 多克隆抗体及免抗 HBxAg 多克隆抗体由美国费城 Thomas Jefferson 大学 Prof.Feit-
10、elson 提供.SABC 试剂盒购自武汉博士德公司. 1.2 方法 石蜡切片常规脱蜡至水,30mL L-1 双氧水 15min,以阻断内源性过氧化物酶活性,1g L-1 蛋白酶消化 5min,100mL L-1 正常羊血清封闭 40min,其余步骤按 SABC 试剂盒说明书进行,DAB 显色,苏木精复染.对照实验:免疫组化用已知 HBxAg 阴性的正常肝组织作阳性对照;以 PBS 缓冲液及正常免疫前血清代替一抗作空白阴性对照.Western blot 法:用 HCC 及其癌旁新鲜手术标本提取蛋白,取等量的蛋白质做聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸纤维素膜转印后,用免抗 C2 多克隆抗体做 Wester
11、n blot 分析.结果判定:显微镜下选取染色结果较理想部,于高倍镜下,每视野统计 200 个细胞数.阴性(-):阳性细胞数比率10%;弱阳性(+):阳性细胞数比率10%;阳性():阳性细胞数比率50%;强阳性():阳性细胞数比率75%,且染色呈深褐色颗粒. 统计学处理:采用 2 检验及 Fisher 精确法. 2 结果 2.1 C2 蛋白的表达 在 HCC 及其癌旁肝组织内 C2 蛋白阳性信号为棕黄色颗粒状,主要位于胞质,HCC 癌旁肝组织内阳性细胞数及阳性反应强度均比癌组织内高,阳性细胞以弥漫型分布为主(Fig1).在 HCC60 例中,C2 蛋白阳性 17 例,占27.3%;42 例 H
12、CC 癌旁组织中,C2 蛋白阳性 35 例,占 83.3%(Tab1).在 LC 上 C2蛋白阳性信号为棕黄色颗粒状,主要位于胞质;阳性细胞以弥漫型分布为主,少数4病例呈局灶性(Fig2).27 例 LC 中 C2 蛋白阳性 21 例,占 77.8%.阳性对照为阳性,阴性、空白对照为阴性.2 检验表明,C2 蛋白在 HCC 组织中的阳性率明显低于其癌旁组 织及 LC 组织(P0.01).Western blot 结果显示,C2 蛋白 Mr 13000,其在 HCC 癌旁中的表达明显高于癌组织(Fig3). 图 1 图 3 略 2.2 HBxAg 表达与 C2 蛋白表达的关系 在 HCC 上 H
13、BxAg 阳性信号为棕黄色颗粒状,阳性表达主要位于胞质,少数位于核内/核膜上,阳性细胞多呈弥漫型分布,少数病例呈局灶性(Fig4).在 HCC60 例中,HBxAg 阳性 49 例(81.7%).在 HBxAg 阳性的 49 例 HCC 中,10 例阳性(20.4%);在 HBxAg 阴性的 11 例 HCC 中, 7 例阳性(63.6%).在 27 例 LC 中,HBxAg 阳性 19 例(70.4%).在 HBxAg 阳性的 19 例 HCC 中,15 例 C2 蛋白阳性(78.9%);在 HBxAg 阴性的 8 例 HCC 中,6 例C2 蛋白阳性(75.0%).2 检验表明,C2 蛋白
14、在 HBxAg 阳性 HCC 组织中的表达明显低于 HBxAg 阴性 HCC 组织(P0.05);而 C2 蛋白在 HBxAg 阳性及 HBxAg阴性 LC 组织中的表达无显著差异(P0.05). 表 1 C2 蛋白在肝组织中的表达 略 图 4 略 3 讨论 Liu 等6 在研究 HCC 时,将 HBVX 基因和氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)分别转入肝纤维母细胞 HepG2,发现一基因因 HBx 而表达下调,后进一步克隆出了其全长基因序列,命名为 C2,并制备了抗体.C2 全长为 1.3kb,是人的蛋白翻译起始因子 eIF1 的全长基因序列.因而 eIF1 的全长基因序列首次被克隆,使对其进一
15、步功能研究成为可能.Liu 等6 对 C2 初步功能研究发现,C2 可抑制细胞生长.我5们的研究结果表明,C2 蛋白在 HCC 组织中的表达明显低于其癌旁组织及 LC 组织,提示 C2 蛋白表达下调可能与 HCC 发生有关.Western blot 结果显示 C2 蛋白Mr 约为 13000,其在 HCC 癌旁组织中的表达明显高于癌组织.这进一步证实 C2蛋白表达减低可能与 HCC 的发生发展密切相关. HBxAg 与 HCC 发病密切相关.HBxAg 可使 HBV 干扰宿主细胞的生化代谢,影响细胞基因的正常表达而诱发 HCC.HBxAg 是一个转录激活蛋白,不能直接与 DNA 结合,其生物学
16、活性均是通过蛋白-蛋白的相互结合而发挥作用,其反式激活作用具有非特异性,广谱性;HBxAg 的反式激活活性显示出细胞特异性而非种族特异性,在 HCC 的发生、发展中起重要作用.如野生型 p53 对细胞生长起负调控作用,可防止恶性肿瘤的发生.p53 基因功能失活与许多肿瘤发生有关7-10 .Liu 等6 发现,C2 功能可被HBxAg 所抑制.本结果显示:C2 蛋白在 HBxAg 阳性 HCC 组织中的表达明显低于HBxAg 阴性 HCC 组织,这进一步证实 HBxAg 对 C2 具有抑制作用,C2 表达下调与 HBV 感染有关.提示 HBxAg 可能通过其反式激活作用与 C2 结合成复合物,导致 C2 功能丧失,从而刺激细胞生长,促进框架转移,导致细胞恶性转化,在翻译水平上诱发 HCC.而在本实验的 LC 组中,C2 蛋白在 HBxAg 阳性及 HBxAg 阴性组中的表达无显著差异,这进一步说明 HBxAg 对 C2 的抑制作用可能与 HCC 的发生密切相关.此外,我们的研究结果还显示:在 60 例 H