黄斑蓝子鱼急性浅水应激反应的特点与牛磺酸的抗应激作用研究

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1、分类号硕 学 位 论 题 目：黄斑蓝子鱼急性浅水应激反应的特点与牛磺酸的抗应激作用研究英文题目：Primary studies on the characteristics of acute shallow waterstress response and the anti-stress effect of taurine in Siganuscanaliculatus姓 名 卢玉标 学 号 11008046所 在 学 院 理 学 院 导 师 姓 名 李 远 友专 业 海洋生物学入 学 日 期 2010 年 9 月 答 辩 日 期 2013 年 5 月学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导

2、下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。作者签名：

3、 导师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日汕头大学硕士学位论文黄斑蓝子鱼急性浅水应激反应的特点与牛磺酸的抗应激作用研究Primary studies on the characteristics of acute shallow water stressresponse and the anti-stress effect of taurine in Siganus canaliculatus学 位 申 请 人：卢玉标导 师：李远友 (教授、博导)专 业：海洋生物学答辩委员会主席：答辩委员会委员：汕头大学海洋生物研究所中国，汕头，515063中文摘要中文摘要鱼类应激时，主要启动两种生理

4、反应系统，即“交感嗜铬组织”系统和“下丘脑垂体肾间组织轴(HPI 轴 )”系统。前者通过交感神经作用于嗜铬组织，使其分泌肾上腺素；后者通过下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH) 作用于脑垂体，使其分泌促肾上腺皮质激素(ACTH) ，进 而刺激 肾间组织释放皮质醇。肾上腺素和皮质醇使血糖浓度升高 ，以满足机体在应激时的能量需要；同时，鱼体细胞通过产生热休克蛋白(HSP)来增强对自身的保护作用。黄斑蓝子鱼(Siganus canaliculatus)是我国东南沿海重要的植食性海水养殖鱼类。该鱼受到刺激后，应激反应较强烈，容易造成鱼体受伤甚至死亡，给养殖生产带来较大损失。为了弄清黄斑蓝子鱼应激

5、反应的特点，开发降低应激反应的方法，本研究选取急性浅水应激作为实验应激处理方式，主要通过测定血清的肾上腺素、皮质醇、胆固醇和葡萄糖等生理生化指标的浓度以及脑中 CRH 和 HSP70 的 mRNA 水平的变化情况，探讨该鱼急性应激反应的特点；同时，通过鱼体浸泡试验评估牛磺酸的抗应激作用。得到的主要结果与结论如下：(1) 对黄斑蓝子鱼给予 4 min 浅水应激后，其血清肾上腺素水平立即显著升高(P 0.05) 。结 果 说 明 ， “交感嗜铬组织”系统可能是黄斑蓝子鱼的急性应激途径之一，鱼体通过释放肾上腺素来提高血糖浓度以满足应激时的能量需要，同时通过诱导细胞 HSP70 的表达来增强鱼体的保护

6、作用 。这提示，血清肾上腺素和葡萄糖浓度以及脑 HSP70 mRNA 水平可作为反映黄斑蓝子鱼急性应激状况的指标。(2) 采用 RT-PCR 和 RACE-PCR 的方法克隆得到黄斑蓝子鱼的 CRH 基因(GenBank 登录号为 KF039716)， CRH 前体 cDNA 序列的全长为 1025bp，其中 5端非编码区有 123bp，3端非编码区为 389bp；编码区为 513bp，共编码 170 个氨基酸。跟其他物种一样，黄斑蓝子鱼 CRH 前体氨基酸序列也由一个推测的信号肽、一个功能未知保守区和 CRH 成熟肽组成。信号肽为 N 端的前 24 个氨基酸，裂解位点位于第 24 和第 25

7、 位氨基酸残基之间；I中文摘要成熟肽位于一个潜在的蛋白水解信号(精氨酸-精氨酸)和一个 C 末端酰胺化信号(甘氨酸-赖氨酸)之间，其氨基酸序列与其他鱼类具有 78%-100%的相似性。应激后黄斑蓝子鱼血清皮质醇浓度和脑中 CRH mRNA 水平没有显著变化(P0.05)，说明黄斑蓝子鱼急性浅水应激时可能没有启动 HPI 轴。(3) 使用 20 ppm 牛磺酸浸泡蓝子鱼 2 d，可显著降低其急性浅水应激后的血清肾上腺素和葡萄糖水平以及脑 HSP70 mRNA 表达量，说明牛磺酸具有一定的抗应激作用。本文首次研究黄斑蓝子鱼的急性应激反应特点及牛磺酸的抗应激作用，研究成果对于丰富鱼类应激生理内容具有

8、较重要的理论意义，同时对于指导养殖生产中减少应激带来的经济损失也具有一定的现实意义。关键词：黄斑蓝子鱼；应激反应特点；牛磺酸；抗应激作用IIAbstractAbstractTwo kinds of physiological systems may respond to acute stress in fish, one is thesympathetico-chromaffin system and the other is the hypothalamic pituitary-interrenal (HPI) axis.In the former system, adrenaline ma

9、y be released into blood from chromaffin tissues under theaction of sympathetic. In the latter system, corticotrophin-releasing hormone (CRH) may bereleased from hypothalamus, and CRH will then stimulate the release of adrenocorticotropichormone (ACTH) from pituitary, and ACTH ultimately stimulates

10、the release of cortisol frominterrenal tissues. Both adrenaline and cortisol may increase the blood glucose concentration tomeet the energy requirement. Meantime, heat shock proteins (HSP) may be produced to enhancethe protective effect of fish body.The rabbitfish Siganus canaliculatus is now an imp

11、ortant herbivorous marine fish farmed insouth-east China. This fish is easily to produce stress response to acute stressor, which leads toharm or death of fish and bring large economic lose to aquaculture industry. In order tounderstand the characteristics of acute stress response and try to find a

12、way to reduce the stressresponse in rabbotfish, we used the acute shallow water stress as the experimental stressapproach in the present study. The serum levels of adrenaline, cortisol, glucose and cholesterol aswell as the mRNA levels of CRH and HSP70 in brain were measured. Besides, the anti-stres

13、seffects of taurine were assessed by a bath test. The primary results and conclusion are as follows:(1) After the rabbitfish were exposed to shallow water for 4 minutes, the serum level ofadrenaline was immediately significantly increased (from 2.000.22 ng/ml to 15.121.04 ng/ml)(P0.05).(3) After S.

14、canaliculatus were bathed in 20 ppm taurine solution for two days, the levels ofserum adrenaline and glucose, as well as brain HSP70 mRNA were significantly reduced afterthe fish were faced acute stress (P0.05) 。说明血清皮质醇和胆固醇浓度不适合作为黄斑蓝子鱼急性浅水应激反应的指标。表 2-4 急性浅水应激后黄斑蓝子鱼血清皮质醇和胆固醇浓度的变化情况Tab.2-4 The changes

15、 of serum cortisol and cholesterol levels in S. canaliculatus post the acute stress指标 Iterm 应激前before stress胆固醇Cholesterol (mmol/L) 3.74 0.13皮质醇Cortisol (ng/ml) 8.43 0.55应激后 post stress (min)0 20 40 60 803.90 0.06 3.84 0.21 3.79 0.29 3.86 0.10 3.65 0.088.78 0.82 8.38 0.79 8.22 0.42 7.72 0.25 8.24 0.

16、622.2.4 急性浅水应激后黄斑蓝子鱼脑 HSP70 mRNA 水平的变化情况急性浅水应激后黄斑蓝子鱼脑 HSP70 mRNA 水平的变化情况见图 3-4。4 min 浅水应激后，脑 HSP70 mRNA 的表达水平逐渐增加，在应激后 60min 达到最大值，为应激前的约16HSP70mRNA相对表达量HSP70mRNArelativeexpression第 2 章 黄斑蓝子鱼急性浅水应激反应特点的研究11.54 倍(P 0.05)。说明 CRH mRNA的表达水平也不适合作为黄斑蓝子鱼急性浅水应激反应的指标。21.81.61.41.210.80.60.40.20应激前 0 20 40 60 80before stress 时间(time) / min图