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1、1丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞 株 SKM-1 分化作用中细胞外信号调节激 酶通路的改变作者：李春蕊，刘文励，孙汉英，周剑锋，邓金牛 【摘要】 本研究探讨细胞外信号调节激酶（ERK）通路在丁酸钠(NaB)诱导人骨髓增生异常综合征细胞株 SKM-1 分化中的作用，阐明丁酸钠诱导 SKM-1 细胞分化的分子机制。用 Western blot 方法检测总 ERK 和磷酸化 ERK 的表达水平；将 ERK特异性的抑制剂 PD98059 与丁酸钠联合应用，观察它们对 SKM-1 细胞生长曲线的影响及分化效应，并用 Western blot 方法检测 P21 和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）蛋白质的表达
2、水平。结果表明：SKM-1 细胞经 1 mmol/L 的丁酸钠作用后，总 ERK的表达水平未发生变化，而磷酸化 ERK 的表达水平下降；丁酸钠及丁酸钠PD98059 均可以上调 P21 和 HDAC 蛋白质的表达水平，且丁酸钠联合PD98059 的作用强于丁酸钠单用。结论：ERK 通路抑制是丁酸钠诱导 SKM-1 细胞分化的重要分子机制。 【关键词】 丁酸钠ERK Pathway Change in the Differentiation of Human MDS Cell Lines SKM-1 Induced by Sodium ButyrateAbstract The study was
3、 purposed to investigate the role of extracellular signal- regulated kinase (ERK) pathway in the differentiation of human MDS cell lines SKM- 1 induced by sodium butyrate (NaB)，and to elucidate the molecular mechanism of differentiation in SKM-1 cells induced by NaB. The expression levels of total E
4、RK and phosphorylated-ERK were determined by Western blot. The effect of NaB in combination with the ERK inhibitor PD98059 on the proli-feration/differentiation of SKM-1 cells was studied，and then the expression levels of the P21 and HDAC protein 2were detected by Western blot. The results showed th
5、at the expression level of phosphorylated ERK was down-regulated by the 1 mmol/L NaB，and the level of total ERK had not changed. NaB or combination of the MEK inhibitor PD98059 with NaB could increase the differentiation of the SKM-1 cells and up-regulated the levels of the P21 and HDAC protein，but
6、the effect of combination of NaB with PD98059 was higher than that of NaB alone. It is concluded that the inhibition of ERK may be involved in sodium butyrate inducing differentiation in SKM-1 cells.Key words differentiation; SKM-1; sodium butyrate; ERK大量研究显示，肿瘤细胞分化与丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated prot
7、ein kinases，MAPK)信号转导途径密切相关。MAPK 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可被多种刺激所活化，活化后可磷酸化核转录因子和其它蛋白激酶等多种底物，调节相关基因的转录，进而参与细胞生长、发育、分裂等多种生理过程。细胞外信号调节激酶 （extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路是 MAPK 系统主要的和经典的通路，主要传递细胞丝裂原信号，参与调节细胞周期及促进细胞增殖分化1。有研究表明2在丁酸钠诱导人大肠癌细胞分化过程中有 ERK 通路的抑制，但有关丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞分化的 ERK 信号转导途径尚无报道。我们前期的研究
8、结果表明3：小剂量的 NaB 可促进 SKM-1 细胞的分化，将细胞周期阻滞于 G0/G1 期，其机制可能是通过上调 P21 的表达和下调细胞周期蛋白-D (cyclin D)与依赖细胞周期蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)的表达实现的。本实验是在我们先前研究的基础上，进一步探讨 ERK 通路在丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞株 SKM-1 分化中的作用，阐明丁酸钠诱导SKM-1 细胞分化的分子机制。材料和方法细胞株及细胞培养3SKM-1 细胞由日本 Ryuji Kawaguchi 教授惠赠，Ryuji Kawaguchi 教授建株于患有 MDS-转为 RAE
9、B-T 后转为 AML 70 岁男性的外周血3，并在 1993 年交于日本 JCRB 细胞库保存。它是一个研究 MDS 发生、发展、DNA 重排改变以及基因不稳定性的非常好的细胞株，呈淋巴细胞形态，强烈表达髓过氧化物酶。采用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液(含有 100 U/ml 青霉素和 100 g/ml 链霉素)，在 37、5% CO2、饱和湿度下培养，取对数生长期细胞进行实验。所有实验均重复 3 次。主要试剂ERK1/2 特异性抑制剂 PD98059 溶于 DMSO 中，置于-80冰箱；丁酸钠（sodium butyrate，NaB)溶于 PBS 中，置于-20冰箱，ER
10、K 抑制剂（PD98059）与NaB 应用时均用 RPMI 1640 稀释到工作浓度。PD98059、NaB 及 DMSO 均购自Sigma 公司，RPMI 1640 和胎牛血清购自 Gibco 公司。药物对细胞生长影响的检测将对数生长期 SKM-1 细胞以 2105/ml 浓度接种于 6 孔培养板上，PD98059以 5、10 和 15 mol/L 加入培养体系中，分为 3 组，然后每组再分为加和不加NaB(1 mmol/L)组，PD98059 提前 1 小时加入培养基中。每种药物浓度设平行 3 孔，培养 4 天后取样进行台盼蓝染色，光镜下计数，连续 3 次。氮蓝四唑(NBT)还原试验将对数
11、生长期 SKM-1 细胞以 2105/ml 浓度接种于 6 孔培养板上，分为 NaB组、PD98059 组、NaBPD98059 组及对照组(未加任何药物处理)组。 NaB 的浓4度为 1 mmol/L，PD98059 的浓度为 5 mol/L，PD98059 提前 1 小时加入培养液中，作用 5 天后，收集细胞，用 RPMI 1640 液洗涤 2 次，再用 2 ml RPMI 1640 液重悬细胞，内含 0.1% NBT，100 ng/ml PMA (Sigma 公司)，37温育 20 分钟后，离心弃上清，加入 100 l DMSO 溶解沉淀，在光镜下观察胞浆含有灰蓝色颗粒的细胞(阳性细胞)
12、，计数 200 个细胞，计算阳性细胞百分率。Western blot 分析丁酸钠对 SKM-1 细胞 ERK 蛋白表达的影响收集 1 mmol/L NaB 作用不同时间后的各组 SKM-1 细胞，PBS 洗 2 次，用三去污试剂提取总蛋白质，Bradford 方法测定蛋白质浓度，取等量蛋白质采用 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离，然后转至 PVDF 膜上；室温下摇动封闭（TBS-T+5%脱脂奶粉）2 小时后，加入鼠抗-ERK1/2 磷酸化抗体(Calbiochem 产品，11 000 稀释)和抗-ERK1/2 抗体（Sigma 公司产品，11 000 稀释），4过夜；室温下洗膜后
13、加入辣根过氧化物酶（HRP）偶联兔抗鼠 IgG（18 000 稀释），最后用化学发光底物进行发光显迹。丁酸钠和（或）PD98059P21 对 SKM-1 细胞 P21 和 HDAC 的表达的影响实验分为 PD98059 组、NaBPD98059 组及对照组(未加任何药物处理)，NaB的浓度为 1 mmol/L，PD98059 的浓度为 5 mol/L。PD98059 提前 1 小时加入培养基中，作用 36 小时后，收集细胞。用三去污试剂提取总蛋白质后测定浓度，垂直电泳进行分离之后转至 PVDF 膜上，封闭 2 小时之后，加入鼠抗人 P21 单克隆抗体和兔抗人 HDAC 多克隆抗体(均购自为 S
14、anta Cruz 公司，11 000 稀释），4过5夜，室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶（HRP）偶联兔抗鼠 IgG 或辣根过氧化物酶（HRP）偶联羊抗兔 IgG（18 000 稀释），显迹。统计学处理两组间连续变量比较用 t 检验，多组间连续变量比较用方差分析，协方差校正，以均数标准误( X 埂繱 E)表示。 结 果药物对 SKM-1 细胞生长的影响PD98059 可以抑制 SKM-1 细胞的生长。组 2(5 mol/L PD98059)、组 3(10 mol/L PD98059 )及组 4（15 mol/L PD98059）与组 1(未加任何药物处理)比较，SKM-1 细胞的数目明显减少，
15、有显著差异性(P0.01)；而组 2、组 3 及组 4 之间差异性不显著(P0.05) （图 1)。因此在下面的研究中我们选用 5 mol/L PD98059 处理细胞。PD98059 与 NaB 有协同性，同时应用对细胞生长的抑制明显增加。同一浓度梯度的 PD98059，加用丁酸钠对 SKM-1 细胞的抑制均明显增加(P0.01) (图 1)。氮蓝四唑(NBT)还原试验SKM-1 经 NaB、PD98059 及 NaBPD98059 处理后，NBT 还原试验发现阳性细胞百分率均较对照组明显增加(P0.05)，两药联用的阳性细胞百分率明显高于单用(P0.05) (图 2)。丁酸钠对 SKM-1
16、 细胞 ERK 蛋白表达的影响6Western blot 检测表明，SKM-1 细胞经 1 mmol/L 的 NaB 作用后，总 ERK1/2的表达水平未发生变化，而磷酸化 ERK1/2 的表达水平在 6、12、36 小时逐渐减少，说明 NaB 在其促 SKM-1 分化的过程中存在着一个持续去磷酸化的过程，ERK 的活性受到抑制。由此推测，NaB 可能是通过抑制了 ERK1/2 信号传导诱导 SKM-1细胞分化(图 3)。丁酸钠和 PD98059 对 SKM-1 细胞的 P21 和 HDAC 表达的影响Western blot 检测表明，SKM-1 细胞经 1 mmol/L NaB 及 1 mmol/L NaB5 mol/L PD98059 作用 36 小时后，P21 和 HDAC 蛋白质的表达水平上升，且NaBPD98059 的作用强于 NaB 单用(图 4)。讨论ERK 属于 MAPK 超家族的经典成员，其在一系列反应如生长因子和有丝分裂等刺激中被激活，同时其持续活化最终促进细胞增殖
