《NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1NKG2D 介导 NK 细胞对鼻咽癌细胞杀伤作 用的体外研究作者：梅家转，郭坤元，魏红梅，常红，宋朝阳 【摘要】 目的 探讨鼻咽癌 CNE2 细胞表面 HLA I 类分子表型和 NKG2D 配体的表达情况，进一步了解其对同种异体 NK 细胞杀伤活性的影响。方法 流式细胞仪检测 NKG2D 的配体 MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3 在 K562、CNE2 细胞的表达情况。PCR SSP 法分析 CNE2 细胞 HLA A、B、Cw 分型和 NK 细胞KIR 分型。LDH 释放法测定 5 例健康者 NK 细胞在不同效靶比时对 K562、CNE2细胞的杀伤活性，效靶比 201
2、 时观察抗 NKG2D 配体的单抗对 NK 细胞杀伤K562、CNE2 细胞活性的影响。结果 CNE2 细胞表达 MICA、MICB、ULBP2，不表达 ULBP1、ULBP3。K562 细胞表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。5 例健康者 NK 细胞抑制性 KIR 与CNE2 细胞表面的 HLA I 类分子之间存在错配。效靶比 51、101、201、301 时NK 细胞对 K562、CNE2 细胞的杀伤活性分别为(29.020.45)%、(10.502.17)%；(44.431.36)%、(27.681.47)%；(57.821.35)%、(36.993.13)%
3、；(71.242.36)%、(55.002.20)%,在各效靶比时 NK 细胞对 K562 细胞的杀伤活性较 CNE2 细胞明显增强(=0.000)；在效靶比 201 时anti MICA、anti MICB、anti ULBP1、anti ULBP2、anti ULBP3 可明显抑制NK 细胞对 K562 细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显著性差异(=0.000)；anti MICA、anti MICB、anti ULBP2 可明显抑制 NK 细胞对 CNE2 细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显著性差异(0.01)，但 anti ULBP1、anti ULBP3 不能2阻断 NK 细胞对 CNE
4、2 细胞的杀伤活性。结论 NKG2D 配体影响 NK 细胞对靶细胞的杀伤活性，提高 NKG2D 配体的表达有可能提高 NK 细胞的抗肿瘤活性。 【关键词】 自然杀伤细胞；NKG2D；杀伤细胞免疫球蛋白样受体Abstract：Objective To analyze HLA class I molecules and the expression of NKG2D ligands in human nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE2) and their effects on cytotoxicity of natural killer (NK) c
5、ells. Methods The expression of NKG2D ligands on the surface of CNE2 and K562 cells were analyzed by flow cytometry. The HLA class I molecules in CNE2 cells and killer cell immunoglobulin like receptors(KIR) expressed by NK cells (isolated from 5 healthy persons) were analyzed by PCR SSP. Cytotoxici
6、ties of NK cells against CNE2 and K562 cells were detected by LDH releasing assay at different effect to target cell ratios (ET). In blocking experiments, different anti NKG2D ligands monoclonal antibodies (mAbs) were added to the target cells at 201 ET ratio. Results It was found that MICA, MICB, U
7、LBP2 were expressed by CNE2, ULBP1, ULBP3 were not detectable on CNE2; K562 expressed all the NKG2D ligands. There were mismatches between inhibitory KIRs expressed by NK cells and HLA class I molecules expressed by the CNE2 cells. NK cells displayed highly in vitro cytotoxicity against K562 and CNE
8、2 cells with anlysis of (29.020.45)%, (10.502.17)%; (44.431.36)%, (27.681.47)%; (57.821.35)%, (36.993.13)%; (71.242.36)%, (55.002.20)% respectively at 51，101, 201, 301 ET ratios(P=0.000). Blocking experiments confirmed that killing of K562 by NK cells was efficiently inhibited by anti MICA mAb, anti
9、 MICB mAb, anti ULBP1 mAb, anti ULBP2 mAb and anti ULBP3 mAb. anti MICA mAb. Anti MICBmAb, anti ULBP2 mAb could partially inhibit the cytotoxicity of NK cells against CNE2 cells, whereas anti ULBP1 mAb and anti ULBP3 mAb could not inhibit the cytotoxicity of NK cells. Conclusion Expression of NKG2D
10、ligands is correlated with the cytotoxicity of NK cells. NK mediated cytolytic activity may be boosted by engineering cells expressing high levels of activating NKG2D ligands.Key words：Natural killer cell; NKG2D; Killer cell immunoglobulin like receptor0 引言NK 细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。NK 细胞表
11、面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Inhibitory killer cell immunoglobulin like receptor,iKIR)与靶细胞表面特定的 HLA I 类分子结合可以明显抑制 NK 细胞的活性，靶细胞缺乏 iKIR 特定的配体将激发 NK 细胞对其杀3伤活性 1。NKG2D 为 NK 细胞的活化性受体，表达于所有的 NK 细胞表面，是介导 NK 细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体。NKG2D 的配体为 MHC I类链相关基因产物(MICA、MICB)及 ULBPS(人巨细胞病毒 UL16 蛋白的结合蛋白 ULBP1、ULBP2、ULBP3)，NKG2D 的配体
12、在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。本研究主要探讨鼻咽癌 CNE2 细胞株 HLA I 类分子表型和 NKG2D 配体的表达情况，进一步了解其对同种异体 NK 细胞杀伤活性的影响。1 材料和方法1.1 材料NK 细胞分离缓冲液（磷酸盐缓冲液，pH7.2，含 0.5% BSA 和 2mM EDTA）及CD56 MicroBeads（Miltenyi Biotec 公司），FITC 标记的山羊抗小鼠IgG1（eBioscience 公司），RPMI1640(Gibco 公司)，淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），rhIL 2(上海华新公司)，NK 细胞杀伤活性检测试剂盒(CytoTox
13、96 Non Radioactive Cytotoxocity Assay，Promega 公司)，KIR PCR SSP 分型试剂盒(Dynal 公司)，PCR SSP A、B、Cw 特异性引物试剂盒（Biotest 公司），流式细胞仪(Coulter 公司)，AMO 1(anti MICA，IgG1)，BMO 1(anti MICB，IgG1)，M295(anti ULBP1，IgG1)，M310（anti ULBP2，IgG1)，M551(anti ULBP3，IgG1)，以上单抗由德国 Alexander steinle 及意大利 Lorenzo Moretta 教授惠赠。人鼻咽癌细胞
14、株 CNE2 由军事医学科学院李春海教授惠赠 2，人慢性髓系白血病细胞株K562 由本室冻存。1.2 方法1.2.1 NK 细胞的分离纯化4采用常规密度梯度离心法分离 5 例健康人外周血单个核细胞，PBS 洗涤 2 次，计数细胞，CD56 MicroBeads 作细胞阳性分选,获得 CD3CD56+细胞，流式细胞仪检测 CD3CD16+CD56+细胞的纯度。1.2.2 细胞培养细胞培养基为含 10%胎牛血清、100U/ml 青霉素和 100g/ml 链霉素的RPMI1640。培养 NK 细胞时加入 1000U/ml 的 rhIL 2。1.2.3 K562、CNE2 细胞表面 NKG2D 主要活
15、化性配体的测定收集对数期生长的 K562、CNE2 细胞，PBS 洗涤后，计数细胞，分管，按1g/106 细胞浓度分别加入 AMO 1、BMO 1、M295、M310、M551，4孵育30min，PBS 洗涤 3 次，以 FITC 标记的山羊抗鼠 IgG1 二抗 4孵育 30min，PBS洗涤，同型 IgG1(Pharmingen 公司)作为阴性对照抗体，流式细胞仪分析样本中1104 个细胞中阳性细胞数，计算表达率。1.2.4 CNE2 细胞表面 HLA A、B、Cw 基因分型采用 PCR SSP 法，按 PCR SSP A、B、Cw 特异性引物试剂盒说明操作。1.2.5 KIR 基因分型采用
16、 PCR SSP 法，按 KIR 基因分型试剂盒说明操作。1.2.6 NK 细胞杀伤活性测定5采用 4h LDH 释放测定法，参照 CytoTox96 Non Radioactive Cytotoxocity Assay 说明操作。抗体封闭试验以效靶比 201 时AMO 1、BMO 1、M295、M310、M551 各 1g 分别与靶细胞室温孵育 15min，然后再加入 NK 细胞测杀伤率。NK 细胞杀伤活性(%)=（实验组 OD 平均值-靶细胞自然释放组 OD 平均值-效应细胞自然释放组 OD 平均值）/（靶细胞最大释放组OD 平均值-靶细胞自然释放组 OD 平均值）100%1.3 统计学处理方法应用 SPSS10.0 软件进行数据处理，采用独立样本 t 检验。 2 结果2.1 NK 细胞的纯度流式细胞仪检测 CD3CD16+CD56+细胞的纯度达 90%以上。2.2 K562、CNE2 细胞表面 NKG2D 的配体表达本研究结果显
