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1、1Amicoumacin B 对 MG63 细胞 bmp2 转 录及蛋白表达作用的研究作者：杨兆勇 张志斐 贺小波 杨隽 孙薇 丁艳 司书毅 张月琴【摘要】 目的 研究 amicoumacin B(04 5195A)对骨形态形成蛋白因子 II(BMP 2)的作用。方法 采用 RT PCR 技术，考察 amicoumacin B 对人骨瘤细胞 MG63 的BMP 2 转录的影响；应用流式细胞分析技术研究 amicoumacin B 对 MG63 细胞BMP 2 的表达的影响。结果 Amicoumacin B 可在 mRNA 和蛋白水平增强BMP 2 的转录及表达。结论 首次证明 amicouma
2、cin B 有上调 BMP 2 的作用。 【关键词】 诺卡菌； Amicoumacin B； BMP 2； 转录； 表达ABSTRACT Objective To investigate the effect of amicoumacin B on bone morphogenetic protein 2 (BMP 2). Methods The effect of amicoumacin B to bmp 2 transcription and expression in MG63 cells were studied by means of RT PCR analysis and Flow
3、cytometry respectively. Result Amicoumacin B can enhance the transcription and expression of BMP 2 at the level of mRNA and protein. Conclusion The activity of amicoumacin B on BMP 2 is proved for the first time.KEY WORDS Amicoumacin B; BMP 2; Transcription; Expression骨质疏松症是由于破骨细胞(osteoclast)和成骨细胞(o
4、steoblast)间功能协调失衡，使骨溶解超过骨形成所致。骨形态形成蛋白因子 II(bone morphogenetic protein 2，BMP 2)在成骨细胞分化过程中起非常关键的作用，除了在骨再生和修复过程中促进成骨细胞的分化并抑制其凋亡外1，2，还能募集并诱导骨髓干细胞分化为成骨细胞及软骨细胞，通过钙盐沉积形成新骨；此外 BMP 2 能促进成骨细胞标志基因 OPN、Cbfa1、Col I alpha1、BSP、ALP 和 fabp4(脂肪酸偶联蛋白 4)等的表达35，因此在很多研究中， BMP 2 被视为治疗骨质疏松的重要2靶标。Amicoumacin B 是一个由短小芽孢杆菌(B
5、acillus brevis)产生的寡肽类抗生素1，曾报道对胃溃疡有一定的保护作用2。本研究在应用以 bmp 2 基因启动子为靶点的新药筛选过程中发现中国医学科学院医药生物技术研究所分离得到的诺卡菌属 04 5195 菌株产生的活性成分 04 5195A 与 amicoumacin B 相同，因此本研究首次发现 amicoumacin B 具有上调 BMP 2 表达的作用。本文报道在 mRNA 和蛋白水平上评价 amicoumacin B 活性的研究结果。1 仪器与试药1.1 仪器PTC 200 DNA 扩增仪，SIGMA3K18 高速离心机(美国 MJ 公司)，REVCO 3000 CO2
6、培养箱，DNA SUB CELLTM 电泳槽，DYY III 6B 稳压稳流电泳仪，CSIM紫外分析仪，Multi Imagetm Light Cabinet Filter Position 凝胶成像系统，BD FACSCalibur 流式细胞仪。1.2 材料Amicoumacin B 由诺卡菌属菌株 04 5195 发酵液分离纯化制得，其结构经 1H和 13C 核磁共振光谱确证，纯度高于 98%；TRIZOL：Invitrogen 公司；RT PCR 试剂盒：Invitrogen 公司；人骨肉瘤细胞 MG63：中国医学科学院医药生物技术研究所保存；山羊抗人 BMP 2 的单克隆抗体：Sant
7、a Cruz 公司；FITC 标记兔抗山羊二抗：北京中杉公司；其余试剂均为分析纯。32 方法与结果2.1 细胞培养人骨肉瘤细胞 MG63 为贴壁细胞，约 48h 传代一次。待细胞长满后，弃旧培养基，加适量 0.25%胰蛋白酶和 0.02% EDTA(11)溶液，在室温下消化约 3min，弃消化液，加入含 10% FBS 的高糖(DMEM)培养基，用吸管反复轻轻吹打瓶皿底壁，使细胞完全脱离瓶皿底壁，分散为单细胞悬液。再按 14 比例接种该细胞悬液于新的细胞瓶内，补加适量含血清高糖 DMEM 培养基(不含任何抗生素)，置培养箱继续培养。培养条件：37，5% CO2。2.2 引物的设计根据已知的人
8、BMP 2 的 cDNA 序列，用 Primer Premier 5.0 生物软件设计引物，扩增 hBMP 2 的 cDNA 片段。hBMP 2 的扩增引物：Sense：5 GGTCCTGAGCGAGTTCGA 3Antisense：3 ACACTACGCCACCTGACG 5GAPDH 的扩增引物：Sense：5 GGGCTCTCCAGAACATCATC 3Antisense：3 ACGGGAGTTGCTGGTGAAAC 52.3 RT PCR 检测 BMP 2 的转录4约 1106 个 MG63 细胞贴壁 8h，换无血清 DMEM，用0、1.0、5.0、10.0、20.0g/ml amic
9、oumacin B 作用 12、24 及 48h，弃培养基，用灭菌PBS 洗涤 2、3 次，用 TRIZOL 提取总 RNA，提取过程按 TRIZOL 操作指南进行。按照两步法 RT PCR 试剂盒使用说明，以总 RNA 为模板、Oigo dT20 为引物逆转录合成 cDNA；以 cDNA 为模板进行 PCR。扩增条件为：94，5min；94，1min；58，40s；72，50s，共 30 个循环。 扩增到 10 个循环后立即暂停扩增，取出 PCR 管置于冰上，每管加入内参 GAPDH 的正义、反义扩增引物各 0.5l/管，混匀后再置于扩增仪内继续扩增。将 PCR 扩增产物与 DNA 电泳上样
10、缓冲液按 51比例混合，在含 0.5g/ml EB 的 1%琼脂糖凝胶上电泳(恒压 100V，1h)。紫外灯下观察电泳结果。结果表明当 amicoumacin B 浓度为 5.0g/ml，作用时间为 48h 时，MG63 的 BMP 2 mRNA 转录水平明显上调如 Fig.1 所示。2.4 流式细胞仪检测 BMP 2 蛋白用 1.0107 个 MG63 细胞铺板 12h，分别加入 0、1.0、5.0、10.0、20.0g/ml 的amicoumacin B，作用 12、24 及 48h，同时设未加药对照和无二抗阴性对照，药物刺激完成后消化并收集细胞，用冷 PBS 洗涤细胞 3 次；细胞用 4
11、%多聚甲醛室温固定 40min，然后加入含 0.2% Triton 100，5%血清的 PBS 2ml 重悬细胞，冰箱放置 10min；每个样品分出部分细胞用于作无一抗阴性对照后，加入山羊抗人BMP 2 的单克隆抗体 140 稀释，饱和剂量(100200l)加入，冰上放置40min，800r/min，离心 3min，用冷 PBS 2ml 重悬细胞再次 800r/min，离心 3min，如此洗涤 2 次，洗去未结合的一抗；加入 FITC 标记的二抗(1100 或 1150 稀释)，冰上避光放置 40min，800r/min 离心 3min，去上清，PBS 洗涤 2 次，洗去未结合的5二抗；过 3
12、00 目尼龙网，上流式细胞仪检测，每管计数 10000 个细胞。实验组BMP 2 的表达值上调率按下式计算：上调率=(%)(实验组荧光值-无二抗阴性对照组荧光值)未加药对照组荧光值结果显示 amicoumacin B 组荧光值明显大于未加药空白对照组，说明amicoumacin B 可上调人 MG63 细胞 BMP 2 蛋白的表达(Fig.2)。以浓度5.0g/ml， 作用 1: 12h; 2: 24h; 3: 48h 时间 24h 的上调效果最明显。3 讨论据文献报道，amicoumacin B 是由短小芽孢杆菌产生7的寡肽类抗生素。Shimojima 等8曾在小鼠实验中证实 amicoum
13、acin B 对紧张引起的胃溃疡有一定的保护作用。Itoh 等9曾报道 amicoumacin B 有抗炎作用，但未见报道对骨形态形成蛋白因子 II(BMP 2)的作用。本研究在筛选以 bmp 2 启动子为靶点的抗骨质疏松新药的过程中发现诺卡菌属菌株 04 5195 产生的活性成分 04 5195A 与amicoumacin B 相同，因此，本研究所用的 amicoumacin B 是从菌株 04 5195 的发酵产物中提取得到的。Amicoumacin B 对 bmp 2 启动子的上调作用为本研究首次发现，为了进一步在基因和蛋白水平上验证 amicoumacin B 对 BMP 2 的作用，
14、采用 RT PCR 技术和流式细胞术(flow cytometry，FCM)对该化合物的体外活性进行了深入研究。在 RT PCR 实验中，选择管家基因 3 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为内参，同目的基因在同一反应体系中同时进行扩增，以排除反应体系中可能存在的影响 PCR 的各种干扰因素，如样本纯度、试剂的影响等。以 bmp 2 mRNA 的转6录量同 GAPDH 的表达量的比值作为半定量检测数据，用以比较不同药物调节bmp 2 mRNA 转录的差异。这种方法比绝对定量法更简单、经济，也更可靠。结果表明当 amicoumacin B 浓度为 5.0g/ml，作用时间 48h 时，MG63
15、 的 BMP 2 mRNA 转录水平被明显上调。流式细胞术技术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，该方法灵敏度高，可以精确地检测细胞量，比较蛋白表达量的差异，尤其适用于测量表达量很低的 BMP 2 这样的蛋白， 结果表明 amicoumacinB 可上调人 MG63 细胞 BMP 2 蛋白的表达。以浓度 5.0g/ml，作用时间 24h 的上调效果最明显。本研究在 mRNA 和蛋白水平上验证了 amicou macin B 上调 BMP 2 mRNA 转录及表达的作用，研究结果为今后探讨 amicoumacin B 在抗骨质疏松方面的药理作用奠定了基础。【参考文献
16、】1 Garrett I R, Chen D, Gutierrez G, et al. Selective inhibitors of the osteoblast proteasome stimulate bone formation in vivo and in vitro J. J Clin Invest,2003,111(11):1771 .2 Chen S, Guttridge D C, Tang E, et al. Suppression of tumor necrosis factor mediated apoptosis by nuclear factor KB independent bone morphogenetic protein/smad Signaling J. J Biol Chem,2001,276(42):39259 .3 Vaes B L, Dechering K J, Feijen A, et al. Compre
