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1、1地蚕指纹图谱的初步研究【摘要】 目的建立地蚕药材的反相高效液相色谱（RP-HPLC）指纹图谱研究方法。方法高效液相色谱法，Lichrospher C18 柱（5 m，4.6 mm250 mm），乙腈-0.25%磷酸水梯度洗脱,流速 1.0 ml/min，检测波长 350 nm，柱温 35。 结果 10 批药材共标定了 25 个共有峰。结论利用地蚕 RP-HPLC 指纹图谱分析方法较全面地反映地蚕药材的内在质量，可用于地蚕药材的质量控制。 【关键词】 地蚕 指纹图谱地蚕又名肺痨草，为唇形科水苏属植物地蚕 Stachys geobombycis C.Y.Wu 的全草及地下部分，主产于浙江、江西、
2、福建等地。该药味淡，微甘，性平，归肺、肾经，具有益肾润肺、滋阴补血、清热除烦等功能，用于治疗咳嗽、哮喘等1，化学研究2报道其有金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、齐墩果酸等成分。杨中林等3以金丝桃苷为对照品高效液相色谱（HPLC）法测定地蚕药材含量。但对地蚕的质量控制方面的研究较少。为了进一步对地蚕药材质量进行科学评价，本实验采用 HPLC 法对不同产地不同采集时间的地蚕进行指纹图谱的研究，同时进行了系统适应性实验和方法学考察，为地蚕药材的鉴定与质量评价提供依据。1 仪器与试药1.1 仪器日本岛津 LC-20AB 高效液相色谱仪( PDA 检测器,LC-solution 色谱工作站）。1.2
3、试药金丝桃苷对照品(南京青泽医药开发有限公司，含量测定 98.48%，批号070415)；地蚕药材经江苏省药品检验所董小平主任药师鉴定；乙腈(色谱纯,山东禹2王实业有限公司)；冰醋酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)，水（二次重蒸水）经过 0.45 m 水系滤膜过滤。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱 Lichrospher C18 柱(5 m,4.6 mm250 mm)，检测波长为 350 nm，进样量 10 l，柱温 35，流速 1.0 ml/min，流动相梯度如表 1，记录时间为100 min。此条件下对照品金丝桃苷的保留时间 18.773 min。2.2 供试品溶液的制备 精密称定粉碎后
4、的地蚕样品约 5 g，加入 75 ml 甲醇，回流 30 min，滤过，将药液浓缩至干，用少量水溶解，分别用石油醚和醋酸乙酯依次萃取，醋酸乙酯层浓缩至干，甲醇定容于 5 ml 量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。表 1 流动相梯度2.3 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷对照品 1 mg，用甲醇溶解，定容于 25 ml 量瓶中(浓度为 40 g/ml)，摇匀即得。2.4 方法学考察 取地蚕样品进行指纹图谱预试验，按上述色谱条件，可得到分离度较好、各峰分布较均匀的指纹图谱，并着重选择了地蚕峰面积较大的 13 个峰，进行方法学考察。2.4.1 精密度实验 精密吸取供试品溶液 10 l，按上述色谱条件
5、，连续进样 5 次，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD 均小于 3.0%，符合指纹图谱色谱技术要求。2.4.2 稳定性实验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于30，2，4，8，12，24 h 进样检测，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，RSD 均小于 3.0%，说明供试品溶液在 24 h 内稳定，符合指纹图谱技术要求。2.4.3 重复性实验 分别精密称定同一批药物 5 份，同法制备样品，进样，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，RSD 均小于 3.0%，符合指纹图谱技术要求。
6、2.5 指纹图谱及技术参数42.5.1 指纹图谱选择及特征峰的标定根据 10 批供试品 HPLC 图谱，选择 7 号供试品作为对照指纹图谱（见图 1）。地蚕药材中金丝桃苷为其主要成分，从指纹图谱中可以看出金丝桃苷色谱峰（保留时间 RT18.833 min，峰面积百分比A%20.05%）积分面积最大，作为参照峰，同时得到各批次地蚕药材 25 个共有峰。图 1 地蚕药材的对照指纹图谱2.5.2 地蚕指纹图谱相似度计算 按上述实验方法检测 10 批地蚕药材的指纹图谱（见图 2），应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A 版，国家药典委员会)计算 10批药材的相似度，结果分别为：0.980，0.925，
7、0.945，0.972，0.986，0.978，1.000，0.991，0.968，0.967。图 2 10 批地蚕药材的指纹图谱2.5.3 共有峰相对保留时间及相对峰面积的比较 参照中药注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)4，对地蚕药材进行 HPLC 色谱指纹图谱测定分析，以参照物金丝桃苷(2 号峰)的保留时间和峰面积为 1，计算 10 批指纹图谱中 25 个共有峰4的相对保留时间及相对峰峰面积。见表 23。 表 2 10 批供试品共有特征指纹峰相对保留时间3 讨论3.1 样品来源 10 批地蚕药材均源于唇形科植物地蚕 Stachys geobombycis C.Y.Wu 全草；产地 14
8、批药材产自浙江省平阳县，58 批药材产自浙江省雁荡山，9、10 批药材产自江苏省徐州市。3.2 色谱条件的考察5 考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-冰醋酸多种流动相系统，其中乙腈-水-冰醋酸系统色谱峰分离度好，故选用。乙腈-水-冰醋酸系统中又考察了 0.1%，0.5%，0.25%3 种冰醋酸浓度，发现冰醋酸浓度为 0.25%时色谱峰分离度最好，故选用。根据二级管阵列检测器检测结果，大部分成分在 280 nm 和 350 nm 时吸收值大，但 280 nm 下干扰强，基线不平稳；350 nm 下各色谱峰分离好、基线平稳，故采用 350 nm 为
9、检测波长。本实验曾采用等度洗脱，由于成分复杂，时间过长，改用梯度洗脱，同时保证大部分色谱峰都能在 100 min 内出峰。 表 3 10 批供试品共有特征指纹峰峰面积3.3 样品制备条件的考察 考察了无水乙醇、95%乙醇、甲醇、75%甲醇、50%甲醇等 5 种提取溶剂，以色谱峰数量、面积、分离度各因素综合考察，无水乙醇作提取溶剂的样品峰个数最少，其他溶剂提取效果相近，但经放置后发现除甲醇作提取溶剂的样品之外，其他样品均有不同程度的沉淀，最后选用甲醇作提取溶剂。然后考察了超声、回流及索氏提取 3 种方法，各样品色谱图基本一致，但回流法提取的样品峰面积最大，故采用回流法。接着分别考察了回流 30
10、min，1 h，1.5 h 对样品5色谱峰的影响，结果各样品色谱图一致，考虑节省能源选用回流 30 min。采用甲醇热回流提取后，需分别用石油醚和醋酸乙酯萃取，除去极性较大和极性较小的成分，富集黄酮类化合物。3.4 参照物的确定 由于地蚕药材黄酮类成分的报道有金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，实验发现金丝桃苷含量较高，且该色谱峰分离度好，故选用金丝桃苷。3.5 不同产地药材指纹图谱相似度评价 10 批不同产地地蚕药材样品的指纹图谱基本一致，因此选择 7 号样品的指纹图谱作为对照指纹图谱，由各批次地蚕药材指纹图谱与对照指纹图谱相似度计算结果可见，10 批样品指纹图谱相似度良好（r0.90）,反
11、应药材的同源性。本方法稳定、可靠、重复性好，可为地蚕原药材及其制剂质量标准的拟定提供依据。【参考文献】1 中药辞海编审委员会.中药辞海M.北京：中国医药科技出版社，1993：1948.2 张中朋，杨中林，唐登峰，等.地蚕化学成分的分离与鉴定J.中成药，2004，26（12）：1051.3 Yang ZL,Tang DF,Cheng QH,et al.The compared study of Hyeroside in the aerial part and its rehizome of stachys geobombycis C.Y.Wu var.geobombycisJ. ITCM，2003，20(4)：24.4 周玉新，雷海明，徐永红，等.中药指纹图谱研究技术M.北京：化学工业出版社，2002：131.5 国家药典委员会.中国药典，部S.北京：化学工业出版社，2005：22.
