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1、1RPHPLC 法测定兔血浆中黄芩苷的含量【摘要】 反相高效液相色谱法； 黄芩苷； 血药浓度 【关键词】 反相高效液相色谱法； 黄芩苷； 血药浓度Abstract:Objective A rapid sensitive RP HPLC method was developed to determine baicalin in the rabbits plasma. Methods The rabbits plasma was pretreated by precipitating with acetonitrile. DiamonsolTM C18 column was used. The m
2、obile phase was consisted of methanol, water and phosphate（55450.2). The flow rate was 1.0 mL/min, and the UV detection was set at 277 nm. Benzoic acid was used as internal standard. Results The linear calibration curves were obtained in the concentration range of 150g/mL(r=0 9993). The within day a
3、nd between day RSD were within 2.8% and 4.0% respectively,relative recovery rate and extraction recovery rate were 95.5% and 62.3% respectively.Conclusions The method is simple, rapid and suitable for the determination of concentration of plasma and the study of pharmacokinetics.Key words:baicalin ;
4、 RP HPLC; concentration of plasma黄芩苷是从唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根提取所得的黄酮类物质，具有抗炎抗变态反应、抗微生物、解热、降压利尿、降血脂血糖、利胆解痉等作用12。黄芩苷是多种中药制剂的有效成分，因此建立黄芩苷的血药浓度测定方法，具有重要意义。本文在文献3 4基础上，进行测定条件优化，采用 RP HPLC 法，以苯甲酸为内标物测定家兔血浆中黄芩苷的含量，此方法具有简便、专属性强、准确及应用性强等优点，为研究其体内代谢提供方法依据。1 仪器与药品 LC 10A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SP
5、D 10AVP 紫外 可见分光光度检测器（日本岛津公司）；HW 2000 色谱工作站。漩涡混合器(天津药典标准仪器厂)；高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；超声波清洗器（天津恒奥超声波清2洗器）。黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号:110715-200514），黄芩苷原料药（广州市亿深天然产物科技发展有限公司），内标物苯甲酸为分析纯（天津市大茂化学试剂厂），甲醇、乙腈为色谱纯（天津市四友生物医学技术有限公司），试验用兔子（购于广东省卫生厅实验动物中心）。2 方法与结果2.1 色谱条件 以文献3中色谱条件为基础改进，色谱柱为 DiamonsolTMC18柱（250 mm4.6 mm,I
6、D,5 m）；流动相：甲醇 水 磷酸（体积比 55450.2）；流速：1 mL/min；检测波长：277 nm；柱温：室温；进样量：10 L。2.2 溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品 25 mg，置 50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得 0.5 mg/mL 的黄芩苷对照品储备液。分别精密吸取黄芩苷对照品储备液 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分别置 10 mL 容量瓶中，用重蒸水定容，配成 5 、25、50、100、150、200、250 g/mL 的系列黄芩苷对照品标准溶液。2.2.2 血浆样品处理取含有一定量黄芩苷的血
7、浆 0.4 mL 至 5 mL 离心管中，加入重蒸水 0.4 mL，内标物溶液（0.45 mg/L 苯甲酸甲醇溶液）0.4 mL，乙腈 0.8 mL，漩涡混合 30 s，超声振荡 5 min，于 3 000 r/min 的高速离心机上离心 10 min，取上清液经 0.45 m 微孔有机滤膜滤过，取续滤液 10 L 进样，记录色谱图。A.空白血浆；B.空白血浆+20 g/L 黄芩苷+90g/L 苯甲酸甲醇溶液；C.血浆样3品a.黄芩苷; b.苯甲酸图 1 样品测定色谱图（略）Fig.1 Chromatograms of rat plasma samples2.3 方法的专属性取空白血浆 0.4
8、 mL，除不加内标物溶液外，按“2.2.2”项下操作，得色谱图 1A，将一定浓度的黄芩苷标准液和内标物溶液加入空白血浆中，依法操作，得色谱图 1B，待测物黄芩苷与内标苯甲酸的保留时间分别为 9.8 min 和11.7 min；取血浆样品，依同法操作，得色谱图 1C。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰待测物黄芩苷及内标物的测定。 2.4 标准曲线和线性范围取空白血浆 0.4 mL，加入黄芩苷标准系列溶液 0.4 mL，配制成相当于黄芩苷血浆质量浓度为 1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/mL，除不加入重蒸水 0.4 mL 外，按照“2.2.2”项下依法操作。
9、进样 10 L，记录色谱图；以待测物质量浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程：Y= 0 085179x-0.00244，r= 0.999 3，表明黄芩苷质量浓度在 150 g/mL 内呈良好的线性关系，定量下限为 0.11 g/mL。2.5 精密度与准确度取空白血浆 0.4 mL 按照“2.4”项下方法制备黄芩苷低、中、高 3 个浓度（5.0，50.0，250.0 g/mL）的样品，每一浓度进行 3 样本分析，连续测定 3 d，并与标准曲线同时进行。以当天的标准曲线计算样品的浓度，求得方法的精密度与回收率，结果见表 1。表 1 黄芩苷的准
10、确度和精密度试验结果（略）4Tab.1 Accuracy and precision of the HPLC determination of baicalin2.6 提取回收率考察取空白血浆 0.4 mL，按“2.4”项下的方法制备低、中、高 3个浓度（5.00，50.0 和 250.0 g/mL）的样品，每个浓度测定 3 个样品。同时另取空白血浆 0.4 mL，除不加重蒸水外，按“2.2.2”项下处理，分取上清液，加入相应浓度的标准溶液 0.4 mL，混匀，进样分析，获得相应的峰面积。以每一浓度 2 种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果表明，黄芩苷血浆浓度在 5.00，50.0 和2
11、50.0 g/mL 时的提取回收率分别为 61.2，63 5，62.3，内标溶液经同法提取处理，其提取回收率为 64.8。2.7 血浆样品的测定 取含有一定量黄芩苷的血浆 0.4 mL，按照“2 2.2”项下进行操作，进行 6 个样本分析，测得血药浓度为 17.96 g/mL，RSD 为 2.1%。3 讨论3.1 内标物的选择根据文献3-6报道，选对硝基苯甲酸作内标物，测定结果与供试品峰重叠；另分别选水杨酸、苯甲酸作内标物，实验结果显示苯甲酸与供试品的分离度在 1.52 0，符合要求，且在室温（1530 ）柱效及分离度不受干扰。3.2 蛋白沉淀剂的选择 分别选用四氢呋喃、乙腈、甲醇作为蛋白沉淀
12、剂及提取溶液，经提取回收率的比较，甲醇的提取率较低，而乙腈和四氢呋喃的效果相当；由于四氢呋喃对色谱测定有干扰，最后选择乙腈作为蛋白沉淀剂及提取液。3.3 本实验的方法准确，简单、灵敏，能满足生物样品分析的要求，为黄芩苷的血药浓度测定提供依据。【参考文献】51 张建春，张华，施瑛，等.黄芩苷的研究近况J.时珍国医国药，2005，16（3）：247249.2 崔凤，袁静，王平全.黄芩苷药理作用研究进展J.中国医院药学杂志,2000，20（11）：685686.3 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部S.北京：化学工业出版社，2005：211212.4 仇峰，何仲贵，程杉，等. RP HPLC
13、法测定兔血浆中黄芩苷含量J .沈阳药科大学学报，2002，19（3）：189191.5 阴健，任天池，曹春林.血浆中黄芩苷的 HPLC 测定方法J.中国实验方剂学杂志，1998，4（1）：46.6 LI Zhang, GE Lin, ZHONG Zuo. High performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of baicalein and baicalein 7 glucuronide in rat plasmaJ.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2004,15：637641.
