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1、1丹参药材水溶性成分含量的 HPLC 法分析作者：李曼玲,冯伟红,康 琛,梁日欣,杨洪军,何希荣,黄璐琦【摘要】 目的 建立丹参药材水溶性成分中丹酚酸 B、丹参素和原儿茶醛的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法测定,色谱柱为 Kromosil C18(4.6 mm250 mm,5 m)；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水(3010159),流动相：甲醇-冰醋酸-水(20180)；流速：1.0 mL/min；检测波长分别为 286、280 nm；柱温 35 。结果 测定了 10 个不同产地的丹参药材,丹酚酸 B 含量在 0.09%6.81%之间,平均回收率为99.64%,RSD1.09%；丹参素的含
2、量在 0.16%0.68%之间,平均回收率为98.94%,RSD1.49%；原儿茶醛的含量在 0.01%0.09%之间,平均回收率为98.96%, RSD1.66%。结论 本法简便、准确、重复性好,可作为丹参药材的含量测定标准。 【关键词】 丹参；丹酚酸 B；丹参素；原儿茶醛；高效液相色谱法Key words：Salvia miltiorrhiza Bge.；Salvianolic acid B；Danshensu；Protocatechuic aldehyde；HPLC丹参为唇形科植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎,味苦,性微寒,归心、肝经,具有祛瘀止痛
3、、活血通经、清心除烦的作用。用于月经不调,经闭通经,癥瘕积聚,胸腹刺痛,热痹疼痛,疮疡肿痛,心绞痛等。丹参的主要药效成分之一是丹参中的水溶性成分,主要是酚酸类化合物丹酚酸 B、丹参素和原儿茶醛。我们采用HPLC 法建立了这 3 种成分的含量测定方法,可用于丹参及其饮片和制剂的研究及质量控制等。21 仪器与试药高效液相色谱仪：HP1100 高效液相色谱仪,G1315A DAD 检测器,G1311A 四元泵,G1313A 自动进样器,G1316A 柱温箱,G1322A 在线脱气机,Agilent ChemStation 色谱工作站。丹酚酸 B 对照品(批号 200201)、丹参素钠对照品(批号 8
4、55-200102)、原儿茶醛对照品(批号 0801-9402)均为供含量测定用,购于中国药品生物制品检定所。乙腈：色谱纯,美国；甲醇：色谱纯,北京化工厂；高纯水：自制；其他试剂均为分析纯。丹参药材由本所生药室提供。2 方法与结果2.1 丹酚酸 B 的含量测定2.1.1 色谱条件色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm250 mm, 5 m)；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水(3010159)；流速：1 mL/min；柱温：35 ；检测波长 s286 nm；理论板数按丹酚酸 B 峰计算应不低于 4 000。在此条件下丹酚酸 B 与其他组分达到良好分离(见图 1)。2.1.2 供试品溶液的制备
5、取本品粉末(过 3 号筛)0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入 75%甲醇 50 mL,密塞,称定重量,加热回流 1 h,取出,放冷,再称定重量,用 75%甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 m)滤过,取续滤液,即得。32.1.3 对照品溶液的制备取丹酚酸 B 对照品适量,加 75%甲醇溶解并制成每 1 mL 含 0.14 mg 的溶液,即得。2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品溶液(0.14 mg/mL) 4、8、12、16、20 L,注入高效液相色谱仪,测定峰面积。以丹酚酸 B 的进样量为横坐标,以峰面积的积分值为纵坐标,绘制标准曲线,并计算回归方程：Y-0
6、.153 6895.6X,r0.999 6,结果表明,丹酚酸 B在 0.562.8 g 范围内呈线性关系。2.1.5 精密度试验取供试品溶液 1 份,在上述色谱条件下连续进样 5 次,每次进样 5 L,测定丹酚酸 B 含量,经计算,RSD0.28%。2.1.6 重复性试验平行制备 5 份供试品溶液,分别在上述同一色谱条件下,分别进样 5 L,测定丹酚酸 B 含量,经计算, RSD2.24%。2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液 1 份,上述色谱条件下,分别于样品制备后第 0、1、2、4、8、16、24 h 进行测定,测定丹酚酸 B 含量,经计算,RSD1.76%。2.1.8 加样回收率试验4取
7、已知含量的丹参药材粉末,分别加入等量的丹酚酸 B 对照品,按上述色谱条件测定,计算回收率,丹酚酸 B 为 99.64%,RSD1.09%。见表 1。表 1 丹酚酸 B 回收率试验结果（略）2.1.9 含量测定按供试品溶液制备方法,分别对 10 个不同来源丹参药材丹酚酸 B 的含量进行测定。结果见表 2。表 2 不同产地丹参药材丹酚酸 B 的含量测定结果（略） 2.2 丹参素和原儿茶醛的含量测定2.2.1 色谱条件色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm250 mm,5 m)；流动相：甲醇-冰醋酸-水(20180)；流速：1 mL/min；柱温：35 ；检测波长 s280 nm。理论板数按
8、丹参素峰计算应不低于 4 000。在此条件下,丹参素、原儿茶醛与其他组分达到良好分离(见图 2)。2.2.2 供试品溶液的制备取丹参药材粉末(过 3 号筛)约 0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入水 25 mL,密塞,称定重量,超声提取 1 h,取出,再加热回流 4 h,取出,密塞,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,滤过。取续滤液,即得。2.2.3 对照品溶液的制备精密称取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量,分别加甲醇溶解,并制成每 1 mL 分别含丹参素钠 0.08 mg(相当于丹参素 0.07 mg)、原儿茶醛 0.012 mg 的溶液,即得。52.2.4 标准曲线的绘制分别精密吸
9、取丹参素钠对照品溶液(0.08 mg/mL)和原儿茶醛对照品溶液(0.012 mg/mL)各 3、6、9、12、15 L,注入高效液相色谱仪,测定峰面积。以丹参素钠和原儿茶醛的进样量(g)为横坐标,以峰面积的积分值为纵坐标,绘制标准曲线并计算回归方程。丹参素钠 Y-7.147 2406.353X,r0.999 1；原儿茶醛 Y-0.772 7 4 943.475X,r0.999 2。结果表明,丹参素钠在 0.241.2 g 范围内呈线性关系；原儿茶醛在 0.0360.18 g 范围内呈线性关系。2.2.5 精密度试验取供试品溶液 1 份,在上述色谱条件下连续进样 5 次,每次进样 5 L,测定
10、丹参素、原儿茶醛含量,经计算,丹参素的 RSD1.26%,原儿茶醛的 RSD0.86%,二者之和的 RSD1.13%。2.2.6 重复性试验平行制备 5 份供试品溶液,分别在上述同一色谱条件下,分别进样 5 L,测定丹参素、原儿茶醛含量,经计算,丹参素的 RSD2.60%,原儿茶醛的 RSD0.66%,二者之和的 RSD2.20%。2.2.7 稳定性试验取供试品溶液 1 份,在上述色谱条件下,分别于样品制备后 0、1、2、4、8、16、24 h 进行测定,测定丹参素、原儿茶醛含量,经计算,丹参素的 RSD0.58%,原儿茶醛的 RSD1.47%,二者之和的 RSD0.58%。62.2.8 加样
11、回收率试验取已知含量的丹参药材粉末,分别加入等量的丹参素钠、原儿茶醛对照品,按上述色谱条件测定,二者回收率分别为 98.94%和 98.96%,RSD 分别为 1.49%和1.66%(见表 3、表 4)。表 3 丹参素钠回收率试验结果（略）表 4 原儿茶醛回收率试验结果（略）2.2.9 含量测定按供试品溶液制备方法,分别对 10 个不同来源丹参药材中的丹参素、原儿茶醛的含量进行测定。结果见表 5。表 5 不同来源丹参药材中丹参素、原儿茶醛的含量测定结果（略）3 讨论在丹酚酸 B 含量测定中,曾经试用过甲醇-乙腈-甲酸-水不同配比的流动相,结果正文采用的流动相配比分离效果最好,所以最终选择其作为流动相。试验过程中曾对供试品的提取溶媒、溶媒用量、提取方法、提取时间等因素进行了考察,结果表明,正文所列的供试品溶液制备方法为各因素最佳组合。
