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1、1CACNA1F 基因在 3T3-L1 脂肪细胞诱导分 化过程中表达变化的研究作者：刘勇 郭锡熔 潘晓勤 倪毓辉 陈荣华【摘要】 目的 观察 3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化过程中 L-型电压依赖钙离子通道 1F 亚基(CACNA1F)基因表达水平的变化，探讨 CACNA1F 基因与肥胖发生的关系。方法 体外培养 3T3-L1 前体脂肪细胞，在诱导 3T3-L1 脂肪细胞分化成熟的不同时段，采用 RT-PCR 技术检测脂肪细胞中 CACNA1F 基因的 mRNA 表达水平。结果 CACNA1F 基因在脂肪前体细胞中表达水平较低，随着脂肪细胞的分化成熟该基因表达水平逐渐升高，至分化第 810
2、天达到高峰。进一步的统计分析发现，CACNA1F 基因的表达水平在细胞分化第 03 天、56 天、810 天 3个时间段内无明显变化外(P0.05)，其余各时间段之间的表达水平差异均有显著性(P0.05)。结论 CACNA1F 基因参与了脂肪细胞分化的调控，与肥胖发生相关，其在 3T3-L1 细胞分化过程中的表达变化可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚。【关键词】 CACNA1F 基因 3T3-L1 前体脂肪细胞 细胞分化.【Abstract】 Objective To investigate the changes of L-type voltage-dependent calcium c
3、hannel 1F(CACNA1F)gene expression during 3T3-L1 preadipocyte differentiation.To explore the relationship between CACNA1F gene and the etiology of obesity.Methods 3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro and differentiated into the matured adipocytes.Total RNA was extracted from adipocytes of vari
4、ous times and the levels of CACNA1F gene mRNA expression were evaluated by RT-PCR.Results In preadipocye，the levels of CACNA1F gene mRNA expression remained at low.In the presence of inducing reagents，the CACNA1F gene mRNA expression was induced at a very early stage and remained at high levels in t
5、he mature adipocyte.There 2was a significant difference between any two detected phases in the levels of CACNA1F gene mRNA expression ，except that the levels of CACNA1F gene mRNA expression did not increase obviously in day 0 to 3 day，5th to 6th day，8th to 10th day.Conclusion CACNA1F gene is involve
6、d in the differentiation of adipocytes and related to the etiology of obesity.The changes in the level of CACNA1F gene mRNA expression during 3T3-L1 preadipocyte differentiation might be contributing to the differentiation and adipogenesis of adipocytes.【Key words】 L-type voltage-dependent calcium c
7、hannel 1F gene 3T3-L1 preadipocyte cell differentiation近年来，我国儿童肥胖的发病率逐渐上升，而且与肥胖相关的一些疾病，如高血压、高脂血症、2 型糖尿病等越来越多地出现在儿童群体中，肥胖已成为危害儿童身心健康的严重医学问题；然而肥胖病因复杂，是机体在遗传、环境、行为、生理、社会、文化等诸多因素相互作用下能量代谢失衡的结果，因此防治难度极大，一些传统的肥胖治疗方法如控制饮食、减肥药物等收效甚微，而且由于儿童正处于身心发育的关键时期，这些方法在儿童中的应用受到限制，因此迫切需要寻找安全有效的肥胖控制治疗方法。钙是饮食中一种重要的成分，自从十多年
8、前人们发现肥胖病人体内脂肪细胞中钙离子浓度升高以来，钙与肥胖的关系逐渐成为一个研究热点，为寻找控制肥胖及其相关疾病的治疗方法开拓了一片崭新的视野。研究表明，细胞内钙离子浓度在与肥胖相关的能量代谢失衡中起关键作用。细胞内钙离子在调控脂肪细胞脂质代谢和甘油三酯沉积中起着重要作用，细胞内钙离子浓度的增加导致脂肪合成基因的表达和脂肪合成的增加、抑制脂肪分解，最终增加脂肪积聚而导致肥胖。低钙饮食可导致 1，25-二羟维生素 D3 的产生增加，刺激钙离子在细胞内流动从而促进肥胖的发生；而高钙饮食可以减少脂肪细胞脂质积聚，增加脂质分解，控制体重增加1，2。在这个过程中，钙离子通道介导的钙离子细胞内流是一个重
9、要环节。因此围绕着钙离子通道及其调控因素开展进一步的研究3具有重要的意义。由于在先前研究中3，应用 cDNA array 技术发现，L 型电压依赖钙离子通道 1F(L-type voltage-dependent calcium channel 1F，CACNA1F)基因差异表达于肥胖和正常大鼠的脂肪组织中，肥胖状态下该基因表达显著上调，提示该基因表达变化与肥胖发生密切相关。为进一步研究该基因与肥胖之间的关系，本研究在成功诱导 3T3-L1 前体脂肪细胞分化成熟的基础上，采用 RT-PCR 技术观察 CACNA1F 基因在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中表达水平的变化，以探讨该基因与脂肪细
10、胞分化及肥胖之间的关系。1 材料与方法1.1 材料 3T3-L1 前体脂肪细胞株由上海中科院生物化学与细胞生物学研究所廖侃教授馈赠，本实验室传代留种，DMEM 培养基、胰蛋白酶、TRIzol 购自美国Invitrogen 公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰岛素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、DEPC 购自美国Sigma 公司，油红 O(oil red-O)染料购自上海化学试剂厂。dNTP、M-MLV 逆转录酶、Oligo(dT)18、Ex-Taq 酶等分子生物学试剂购自美国 Promega 公司，PCR Mar
11、ker 购自华美生物工程公司，引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成。1.2 方法1.2.1 3T3-L1 前体脂肪细胞培养和诱导分化 根据 3T3-L1 细胞培养和诱导分化方案4，用完全培养液(DMEM+10%FBS+100u/ml 青、链霉素)，在 37孵箱(5%二氧化碳，95%空气)中培养细胞，每 2 天换液 1 次。待细胞生长至完全融合后 2天(第 0 天)，开始诱导分化，具体步骤为：将培养液换成含 0.5mmol/L MIX、1mol/L 地塞米松和 5mg/L 胰岛素的完全培养液；48h 后，撤去 MIX 和地塞4米松，使完全培养液中只含有 5mg/L 胰岛素；2 天后换液，撤去胰岛
12、素，使用不含有任何诱导剂的完全培养基；以后每 2 天换液 1 次，直至第 10 天 95%以上细胞已分化为成熟的脂肪细胞。收集分化不同时间段(010 天)的细胞，置-70冻存备用。1.2.2 3T3-L1 细胞鉴定 油红 O 染料经异丙醇溶解后过滤，置 4备用。取分化不同时间段(010 天)的细胞，先用 0.01M PBS 洗 2 遍，加入 3.7%甲醛固定 2min，再用清水洗净，加入油红 O 染液染 1h，水洗至背景透明。经油红 O 染色、苏木素复染，显微镜下观察结果，细胞质中脂滴呈亮红色、细胞核呈蓝色。拍照，记录细胞的分化情况。1.2.3 RT-PCR 方法检测 3T3-L1 细胞中 C
13、ACNA1F 基因 mRNA 的表达水平 取细胞 200l(约 4105 个细胞)，TRizol 法提取 3T3-L1 细胞的总 RNA，定量后取1g，以 Oligo(dT)18 为引物进行逆转录，反应体系 20l。取逆转录产物 1l 为模板进行 PCR 扩增，PCR 反应体系 20l。小鼠 CACNA1F 基因的上游引物序列：5-ATC ATC ATC TTC TCC CTG CT-3，下游引物序列：5-CAC CAC ATG CTT GAG TCC CT-3，产物长度 987bp；内参照小鼠 GAPDH 基因的上游引物序列：5-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3，下游
14、引物序列：5-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3，产物长度 432bp。PCR 反应条件为：预变性 95 2min，变性 94 30s，退火 52 30s(GAPDH 基因：52 30s)，延伸 72 30s，共 30 个循环(GAPDH基因：30 个循环)，终末延伸 72 5min。所选用 PCR 反应的模板量及循环数均使PCR 产物量位于反应曲线的线性范围内。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用 UVP 凝胶密度扫描仪对 CACNA1F 基因和 CAPDH 特异性扩增产物的电泳条带进行密度扫描，用 Labwork 3.0 软件测定电泳条带密度值，CACNA1F
15、 基因mRNA 的表达水平以该基因条带密度占 GAPDH 基因条带密度的百分比(%)表示。51.3 统计学方法 数据均以均数标准差(xs)表示，用 Excel 统计软件和 SPSS 10.0 统计软件进行数据整理和统计。多组间均数比较采用方差分析 F 检验，组间两两比较采用 q 检验，P0.05 示结果具有统计学意义。2 结果2.1 细胞染色鉴定结果 诱导分化前，3T3-L1 前体脂肪细胞呈梭形成纤维细胞形态，细胞核呈蓝色，细胞质内未见亮红色颗粒；细胞生长至完全融合后 2 天(第 0天)开始诱导分化，第 2 天到第 6 天细胞形态发生明显变化，细胞逐渐由梭形变为圆形，胞体变大变圆，细胞质内被油
16、红 O 染成亮红色的脂滴逐渐增多增大；第 6天时，约 60%的细胞已分化成熟；第 10 天时，可见含有亮红色脂滴的成熟脂肪细胞在视野中占 95%以上，细胞体积大、形态圆。2.2 3T3-L1 脂肪细胞诱导分化过程中 CACNA1F 基因表达水平的变化 见图 1、图 2、表 1。由图表可见，CACNA1F 基因在脂肪前体细胞中表达水平较低，随着脂肪细胞的分化成熟该基因表达水平逐渐升高，至分化第 810 天达到高峰。进一步的统计分析发现，CACNA1F 基因的表达水平在细胞分化第 03 天、56 天、810 天 3 个时间段内无明显变化外(P0.05)，其余各时间段之间的表达水平差异均有显著性(P0.05)。 图 1 3T3-L1 脂肪细胞分化中 CACNA1F 基因表达水平的检测(M：PCR Markers，010：细胞分化时间) 6图 2 3T3-L1 脂肪细胞分化中 CACNA1F 基因表达水平的变化表 1 3T3-L1 细胞诱导分化过程中 CACNA1
