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1、1RNA 干扰 Nucleostemin 基因对人食管癌 Eca109 细胞株增殖影响的实验研究作者：郑学芝，刘桂莲，李丽，孙卫，念红，胡静,蔡子微【摘要】 目的 筛选 NS 基因特异性 siRNA 阳性细胞克隆，研究 NS 基因特异性RNA 干扰对 Eca 109 细胞株体外增殖能力的影响。方法 用脂质体法将 NS 特异性 siRNA 表达载体转染 Eca 109 细胞，Zeocin 抗生素压力筛选后用 PCR 方法鉴定阳性克隆；MTT 法检测各组细胞的生长增殖情况，RT PCR 方法检测 NS 基因表达量的变化情况。结果 与对照组比较，silencer 组肿瘤细胞趋于分化，细胞增殖抑制率超
2、过 80%(P0.01)，差异具有显著性； NS 基因表达量下降。结论 NS 基因特异性 RNA 干扰抑制人食管癌 Eca 109 细胞株体外增殖，使 NS 基因表达量下降。 【关键词】 Nucleostemin（NS）;RNA 干扰；食管癌；基因表达；细胞增殖Abstract：Objective To screen NS gene specific positive cell clones,and investigate the effect of human esophagus cancer Eca 109 cells proliferation in vitro by NS gene s
3、pecific RNA interference.Methods The NS siRNA expression vector was transfected into human esophagus cancer Eca 109 cells using LIPOFECTAMINETM2000 Reagent, and positive clones were examined by PCR after stable transfectans screening with Zeocin; detected the cell proliferation by MTT assay and the
4、levels of NS gene expression by RT PCR.Results Compared with the two control groups, the silencer group cells were nearer differetiation,the proliferation inhibitory rate was higher than 80%(P0.01)；the level of NS gene expression reduced.Conclusion The NS gene specific RNAi can significantly inhibit
5、 human esophagus cancer Eca 109 cells proliferation in vitro and reduce the level of NS gene expression.Key words：Nucleostemin（NS）; RNA interference; Esophagus cancer； Gene expression; Cell proliferation0 引言2NS 基因是美国国立卫生研究院的学者 Mckay and Tsai 2002 年新发现的一种蛋白质核因子1，该基因在干细胞及人类的数种肿瘤细胞中表达丰度很高，但在分化的成体组织中，该基
6、因却不表达。二位学者提出干细胞与癌细胞均由相同的蛋白质NS 来决定其细胞自我复制的能力，NS 可能是干细胞和肿瘤细胞通过G2/S 检验点的特异性调控因子。本文将以人食管癌 Eca 109 细胞株为实验材料探讨 NS 基因特异性 RNA 干扰对食管癌 Eca 109 细胞株体外增殖能力的影响。1 材料和方法1.1 材料人食管癌 Eca 109 细胞购于上海细胞所； 1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶为Gibco 公司；PCDNA4/C NS silencer 质粒 2；MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：Invitrogen 公司;RNA、DN
7、A试剂盒;RT PCR 试剂盒：TaKaRa 公司;引物合成：上海申能博彩生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养及 NS 基因转染人食管癌 Eca 109 细胞培养于含 10%FBS 的 RPMI 1640 培养基中，置于 37、5%CO2 潮湿空气的 CO2 培养箱内培养。脂质体法将 PCDNA4/C NS silencer 质粒及空载体 PCDNA4/C vector 质粒转染 Eca 109 细胞，分别命名为 silencer 组、vector 组，未转染的 Eca 109 细胞记为 normal 组。转染细胞进行 Zeocin 抗生素筛选；阳性细胞克隆继续在含 Zeocin
8、 抗生素的培养基中进行扩大培养。1.2.2 阳性细胞克隆的鉴定3提取克隆细胞基因组 DNA，以 Zeocin 基因为目的基因，通过 PCR 方法进行细胞克隆外源基因整合阳性鉴定，同时以 normal 组肿瘤细胞作对照。其引物序列为：上游引物 5 atggccaagttgaccagtgc；下游引物为 5 tcagtcctgctcctcggcca。 PCR 反应条件为：94预变性 5min，然后 94变性 30sec，60退火 30sec，72延伸30sec，共 30 循环，最后 72延伸 10min；PCR 产物大小约 370bp。1.2.3 生长曲线的绘制 3将三组细胞传到 24 孔板上（11
9、04 细胞/孔），每组 18 复孔，分别于24h、48h、72h、96h、120h、144h 用计数板进行活细胞计数，绘出各组细胞的生长曲线。1.2.4 细胞的形态学观察倒置显微镜下观察各组细胞形态变化情况。1.2.5 MTT 比色法测定细胞增殖抑制率 3在 96 孔培养板上接种三组细胞，每组 24 复孔（1103 细胞/孔），分别于24h、48h、72h 三个时间段进行 MTT 测定，以培养液做空白对照并调零，用酶标仪测定 490nm 处的吸光度值（OD 值），每次每组测定 8 复孔。细胞增殖抑制率1-细胞存活率即细胞增殖抑制率（1-silencer 组 OD 值 / Normal 组 OD
10、 值）100%41.2.6 各组肿瘤细胞 NS 基因表达水平检测提取肿瘤细胞总 RNA，用 RT PCR 方法验证各组肿瘤细胞 NS 基因表达情况。参照 genebank 中 NS 和 GAPDH 的基因序列及参考文献 4设计引物如下:NS 基因上游 P1：5 atgaaaaggcctaagttaaagaaagc，下游P2：5 gctctccaaattctcctttggta；GAPDH 上游为 P3：5 ggtggacctgacctgccgtctaga，下游 P4：5 ttactccttggaggccatgtggg；扩增产物长度分别为 570bp 和 280bp，在同一体系内反应，PCR 反应
11、条件为 94预变性 5min， 94变性 30sec，50退火30sec，72延伸 30sec，共 30 循环，最后 72延伸 10min。 1.2.7 统计学分析实验数据以s 表示，统计学处理采用 SPSS 11.5 软件，进行 t 检验。2 结果2.1 PCR 法鉴定阳性细胞克隆抗 Zeocin 的细胞克隆部分 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果见图 1；silencer 组与vector 组皆检测到 Zeocin 基因条带，而 normal 组无，即细胞克隆外源基因整合阳性。2.2 细胞生长曲线的绘制各时间段 silencer 组细胞数目低于对照 vector 组（P0.01）和 norma
12、l 组（P0.01），差异具有显著性；细胞生长曲线见图 2。2.3 各组细胞的形态学变化silencer 组细胞与对照 vector 组和 normal 组相比体积变小并趋向于均一，多数细5胞由梭形趋向变圆，核质比变小，瘤巨细胞减少，细胞趋于分化。2.4 MTT 比色法测定细胞增殖能力细胞培养 24h 后，silencer 组细胞增殖抑制率分别为 normal 组（P0.01）的 94%和 vector 组（P0.01）的 93%；细胞培养 48h 后，silencer 组细胞增殖抑制率分别为 normal 组（P0.01）的 80%和 vector 组（P0.01）的 78%；细胞培养 72
13、h 后，silencer 组细胞增殖抑制率分别为 normal 组（P0.01）的 88%和 vector 组（P0.01）的 87%；细胞增殖曲线见图 3。2.5 各组肿瘤细胞 NS 基因表达水平silencer 组肿瘤细胞 NS 基因表达水平明显低于对照 vector 组和 normal 组，见图4。3 讨论NS 基因是一种 p53 结合蛋白，主要存在于核仁中，在核质中也有低量表达；在干细胞处于早期多潜能状态时该基因的表达丰度很高，而在分化开始时，这个基因的表达却突然几乎完全消失 1。本室与中科院遗传发育研究所合作证实了多种肿瘤组织中都有 NS 基因的表达 5，6，运用 siRNA 真核表
14、达载体，使宫颈癌Hella 细胞的增殖被抑制，细胞内 NS 基因的表达量下降 7，8。本实验将 PCDNA4/C NS silence 载体转染人食管癌 Eca 109 细胞，同步转染PCDNA4/C vector 空载体作对照。经过 Zeocin 抗生素压力筛选获得阳性细胞克隆，并通过 PCR 方法验证克隆细胞外源基因整合阳性。与对照组 vector 和 normal组比较，silencer 组细胞的肿瘤生物学行为发生了显著的变化，细胞增殖明显变慢，6趋向于分化； MTT 法进行细胞增殖抑制率测定显示 silencer 组细胞的增殖速率明显低于两对照组；细胞增殖抑制率大于 80%；各组细胞
15、RT PCR 产物电泳结果显示 silencer 组肿瘤细胞中 NS 基因表达量明显下降。实验结果表明，我们构建的针对 NS 基因的特异性 siRNA 的表达载体PCDNA4/C NS silencer 是成功并有效用的，将其转染入人食管癌细胞后，通过RNA 干扰机制使部分 NS 基因沉默，从而产生了抑制 Eca 109 细胞分裂、增殖的效应。同时提示调节 NS 基因活性可能对肿瘤有防治作用， NS 基因能够预测肿瘤的发展趋势，有可能成为一种新的肿瘤标记物。但是 NS 蛋白活动的精确分子机制尚不完全清楚，这仍然需要大量的实验工作去证实。运用 RNA 干扰技术对NS 基因进行深入研究可能会揭示或
16、部分揭示干细胞和肿瘤细胞增殖之迷，为肿瘤的早期诊断、基因治疗和预后及以干细胞为基础的组织工程等提供理论依据和工作基础。【参考文献】1Tsai RY，Mckay RD.A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells J.Genes Dev,2002,16(23):2991 3003.2 蔡子微，刘思金，劳为德，等 . NS 特异性 siRNA 真核表达载体的构建 J. 牡丹江医学院学报，2003，24（3）:1 4.3 薛庆善. 体外培养的原理与技术 M. 北京：科学技术出版社，2001.340 343.4 刘思金，薛延，劳为德，等.人类骨桥蛋白（hOPN）在细胞增殖中的功能研究 J. 高技术通讯，2003，3（2）：25 28.75 刘思金，蔡子微，胡国法，等. NS 基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚胎肾细胞 NS 基因的表达
