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1、- 1 -酵母蔗糖酶的分离提取酵母蔗糖酶的分离提取姓名：姓名：xxxxxx 学号：学号：xxxxxxxx 指导老师：指导老师：xxxx xxxx 大学大学 xxxx 学院学院 1010 级级 1 1 班班 邮编：邮编：xxxx 摘要：摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过乙醇的分级与透析，得到较高纯度的酵母蔗糖酶。并对每次所提取的蛋白质浓度、酶活性、纯化倍数及产量做了相应的计算。最后所得的纯化倍数为 14.41 倍，产量为59.56%。 关键词：关键词： 酵母 蔗糖酶 酶活力 自溶法 产量 前言：前言：生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动
2、的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及其他研究，越来越需要纯度高的酶制剂。蔗糖酶又称转化酶，可作用于 -1,2 糖苷键，将蔗糖水解为 D-葡萄糖和 D-果糖。可用于转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖。蔗糖酶在畜牧方面，可防治禽兽的疾病，促进幼龄禽兽的发育，节约饲料和提高肉产量等；在农业方面可防治植物病害、刺激植物生长、提高作物产量；在工业上可用作鱼、肉、蔬菜和水果等食品的保鲜剂。 1.1.材料与方法材料与方法 1.11.1 试剂试剂 酵母粉（实验室提供） ， 醋酸钠(0.5g)，
3、 乙酸乙酯（8ml） ，10%醋酸，无水乙醇， 1mol/LNaOH，蒸馏水，PH=4.7 缓冲液，DNS 试剂，0.9%NaCl，考马斯亮蓝 G-250，系列标准 蛋白液，150mol/L 磷酸等。 1.21.2 器材器材 离心机，722 分光光度计，水浴锅，量筒 25ml，烧杯 100ml，大小试管若干，各种专用移 液管，吸耳球，玻离棒，胶头滴管，PH 试纸等。 1.31.3 方法方法 1.3.1 蔗糖酶粗品制备方法 （1）自溶法 将 5g 酵母粉倒入 500mL 烧杯中、少量多次的加入 15mL 蒸馏水搅拌均匀，成糊 状后加入 0.5g 乙酸钠、8mL 乙酸乙酯，搅匀，盖好，于 35恒温
4、水浴中搅拌 30min。(注：整个 实验应避免高温，以防止酶失活) （2）抽提 补加蒸馏水 10mL，搅匀，盖好，于 35恒温过夜，4000r/min 离心 10min 弃沉淀， 得 E1;量体积 V1=17.3mL,取出 2mL 置于 4冰箱保存，待测酶活力及蛋白质浓度(留样 1)。 （3）乙醇分级和透析 测 E1 PH：用 10%HAC 调 PH 至 4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过） ，共加入 0.7mL 10%HAC。 第一次乙醇分级（30%乙醇饱和度） 计算出使得乙醇浓度达 30%时所需的无水乙醇的体积为 6.9ml，将和乙醇 ，放入冰浴中预冷，在不断搅拌下缓慢滴加乙醇，400
5、0/min 离心 10min，弃沉淀，留上 清，得 E2；得到上清液为 V2=20.2ml（留样） 。 第二次乙醇分级（50%乙醇饱和度） 同上法加入（为达 50%乙醇饱和度时需要补加的无水乙醇的体积） ，计算的加入无水乙 醇为 7.3mL。4000/min 离心 10min，弃上清，沉淀立即用 10ml 150mol/LPH6.0 的磷酸溶 解，并装入透析袋，透析小时， 4000/min 离心 10min，得 E3，量体积 V311.3mL（留样 ） 。 测定各步的总蛋白、总活力、并据此计算比活、回收率和纯化倍数。- 2 -纯化倍数=每次比活力/第一次比活力 产量（%）=每次总活力/第一次总
6、活力1.3.2 蛋白质浓度测定考马斯亮蓝 G250 染色法 考马斯亮蓝 G250 在酸性溶液中呈棕褐色，它与蛋白质通过疏水结合作用后，变为蓝色，最 大吸收光谱从 470nm 移至 595nm，在一定条件下，蛋白质的浓度与 595nm 吸收度成正比例。该 法灵敏度在 0.011.0ug/ml。 （1）蛋白质标准曲线的制作表表 1 1 蛋白质定量测定标准曲线制作蛋白质定量测定标准曲线制作溶液 管 管 管 管 管 管系列标准蛋白液mL 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0实际蛋白质含量ug 20 40 60 80 1000.9%生理盐水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 蛋白质染色液m
7、L 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0轻轻摇匀，5min 后以 0 号管调空白，595nm 分光光度法测光密度值，测得结果为：试管 值 0.079 0.204 0.315 0.394 0.508根据结果绘出标准曲线：00.10.20.30.40.50.600.020.040.060.080.10.12蛋白质含量（mg)OD 值图图 1 1 蛋白质标准曲线蛋白质标准曲线 根据上图的蛋白质标准曲线得到公式：y=5.06x (y:OD595值；x:蛋白质含量/mg) （2）蛋白质浓度测定 从留样中取 0.3ml 加 0.9%的 NaCl 稀释至 3ml（根据实际情况来确定稀释倍数） ，再
8、按以下 表格操作测定表表 2 2 蛋白质浓度蛋白质浓度 OD595595值值溶液 对照组 留样 留样系列标准蛋白液/ml 0.5 0.5 0.9%生理盐水/ml 1.0 0.5 0.5 蛋白质染色液/ml 5.0 5.0 5.0- 3 -1.3.3 蔗糖酶活性测定 (1) 酶活性测定 取 5%的蔗糖、酶液 5ml 分别于 35水浴中预热 5min若酶浓度过高，用 0.2mol/L 的醋酸 缓冲液（PH=4.7）适当稀释 表表 3 3 蔗糖酶水解蔗糖蔗糖酶水解蔗糖试管 0 管 1 管 5%蔗糖（mL） 2 21mol/L NaOH(mL) 0.5 酶液（mL） 2 2 35水浴，3min 1mo
9、l/L NaOH(mL) 0.5表表 4 4 还原糖的测定还原糖的测定试管 0 管 1 管 2 管反应液（mL） 0.5 0.5 0.5（取自表 1 中 0 管） （取自表 1 中 1 管） （取自表 1 中 1 管）DNS 试剂（mL） 3 3 3水（mL） 1.5 1.5 1.5沸水浴 5min 后，立即流水冷却水（mL） 20 20 20OD520在葡萄糖标准曲线上找到所测定光吸收值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力： 蔗糖酶活力单位葡糖糖毫克数9酶的稀释倍数/2 葡萄糖标准曲线公式为：y=0.0746x+0.0024 （y:OD520值；x:葡萄糖含量/mg ） 在本实验条件下，每
10、 3min 释放毫克还原糖所需的酶量，定义为一个活力单位。 2.2.结果与分析结果与分析 2.12.1 结果结果 经测量和计算得表表 5 5 蛋白质浓度蛋白质浓度OD595项目E1 E2 E31 0.792 0.356 0.050 2 0.803 0.354 0.055平均 0.797 0.355 0.053 蛋白质含量（mg） 0.158 0.070 0.010蛋白质浓度（mg/mL） 3.160 1.400 0.200- 4 -表表 6 6 酶活力测定酶活力测定OD520项目E1(稀释 150 倍) E2(稀释 100 倍) E3(稀释 100 倍)1 0.275 0.161 0.3722 0.279 0.172 0.384平均 0.277 0.1665 0.378葡萄糖毫克数/mg 3.681 2.200 5.035蔗糖酶活力单位 248.47 99.00 226.58 表表 7 7 蔗糖酶分离提取效果计算蔗糖酶分离提取效果计算留 体积 蛋白质浓度 总蛋白 活力 总活力 比活力 纯化 产量样 mL (mg/ mL) (mg) （U/ mL） （U） (U/ mL ) 倍数 （回收率）1 17.3 1.58 27.33
